調(diào)控巨噬細(xì)胞自噬對(duì)結(jié)核分支桿菌清除作用的影響.pdf

1、目的：自噬(Autophagy)是廣泛存在于真核細(xì)胞中的生命現(xiàn)象,是生物在其發(fā)育、老化過(guò)程中都存在的一個(gè)凈化自身多余或受損細(xì)胞器以及維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的共同機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)對(duì)鼠肺原代巨噬細(xì)胞和活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)說(shuō)明三甲基腺嘌呤,雷帕霉素調(diào)控巨噬細(xì)胞自噬對(duì)結(jié)核桿菌清除作用的影響,以證明白噬作用在細(xì)胞內(nèi)病原體清除中的地位。
　　 方法：分為體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)兩部。第一部體外實(shí)驗(yàn):通過(guò)灌洗健康大鼠肺部,得到原代巨噬細(xì)胞后將細(xì)

2、胞分為四組:空白對(duì)照組,三甲基腺嘌呤組,雷帕霉素組,IFN-γ組(陽(yáng)性對(duì)照組)。各組均用胎牛血清DMEM培基培養(yǎng)2天,再分別加入三甲基腺嘌呤60mg/L作用3小時(shí)；雷帕霉素50nmol/l作用36小時(shí),IFN-γ400U作用3小時(shí)后再分別加入結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株1×lO^7 CFU/L共培育3小時(shí),用PBS pH7.4緩沖液沖洗3次以洗脫未結(jié)合的H37Rv菌株,將沖洗液做熒光定量PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬后剩余結(jié)核分枝桿菌DNA濃度,

3、以檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞清除結(jié)核桿菌的情況；第二部體內(nèi)試驗(yàn):將20只BALB/C小鼠(6周齡)隨機(jī)分為四組,分別腹腔注射:3-甲基腺嘌呤雷帕霉素 IFN-γ,空白組不注射后霧化感染結(jié)核桿菌。7w后脫頸椎處死,無(wú)菌條件下取肺組織分別做病理切片HE染色和抗酸染色,結(jié)核桿菌菌落計(jì)數(shù)以檢測(cè)結(jié)核桿菌在活體內(nèi)的清除情況。
　　 結(jié)果：⑴熒光定量PCR法檢測(cè)四組巨噬細(xì)胞吞噬后的結(jié)核桿菌,實(shí)時(shí)監(jiān)控雷帕霉素組與IFN-γ組(陽(yáng)性對(duì)照組)結(jié)核桿菌數(shù)量明顯

4、低于空白對(duì)照組和三甲基腺嘌呤組。比較雷帕霉素組與IFN-γ,組(陽(yáng)性對(duì)照組)分別和空白對(duì)照組,三甲基腺嘌呤組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,空白對(duì)照組和三甲基腺嘌呤組之間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑵肺組織病理切片兩種染色結(jié)果均顯示雷帕霉素組與IFN-γ組(陽(yáng)性對(duì)照組)肺組織病理變化明顯輕于空白組和三甲基腺嘌呤組。⑶肺組織均漿液結(jié)核桿菌菌落計(jì)數(shù)顯示雷帕霉素組和IFN-γ組(陽(yáng)性對(duì)照組)菌落計(jì)數(shù)最少且雷帕霉素組與IFN-γ組(陽(yáng)性對(duì)照組)分別和空白對(duì)照組,