神經生長因子基因重組逆轉錄病毒表達載體的構建及其在神經干細胞中表達的實驗研究.pdf

1、研究背景：阿爾茨海默病(AD)，也稱老年性癡呆，是一種以進行性學習記憶能力減退和認知功能障礙為主的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，伴有不同程度的運動、語言和人格等多方面的異常。目前，我國正步入老齡化社會，老年人口不斷增多，AD患者越來越多。但由于AD發(fā)病機制未明，目前尚無有效的治療方法，給家庭、社會帶來沉重負擔。因此，尋找有效的AD治療方法已成為當今醫(yī)學界的迫切課題。 神經營養(yǎng)因子(NTFs)是由靶細胞分泌的一組特異性蛋白分子，有促進和

2、維護神經元生長、存活、分化和執(zhí)行功能的作用。神經生長因子(NGF)是最重要的神經營養(yǎng)因子之一，對神經細胞的生長、增殖、分化、存活以及凋亡，具有重要的作用。在正常腦內，皮質和海馬產生的NGF逆向運輸?shù)交浊澳X，作用于膽堿能神經元的NGF受體(NGFR)，能提高膽堿乙酰轉移酶ChAT水平，防止膽堿能神經元萎縮，促進膽堿能神經元存活，增加存活膽堿能神經元的功能，提高學習記憶。動物實驗顯示，腦室內灌注NGF，可使AD模型鼠基底前腦膽堿能神經元7

3、0％-90％維持存活。NGF為生物大分子，靜脈給藥不能透過血腦屏障，直接腦內注射，不僅可能損傷腦組織，帶來感染風險，還容易引起雪旺細胞、感覺和交感神經元異常增生等副作用。因而，選擇適當?shù)慕o藥途徑，成為目前需要解決的重大課題?；蜣D染是目前能提供長期療效的治療方法，基因修飾的細胞腦內移植現(xiàn)已成為研究的重點。 近年來，神經干細胞(NSCs)作為中樞神經系統(tǒng)移植、轉基因的細胞載體和損傷修復材料，利用神經干細胞進行移植治療，或通過病毒載

4、體將目的基因導入神經干細胞，為神經系統(tǒng)退行性病變和神經損傷的臨床治療帶來新的曙光。NSCs能夠不斷分裂增殖、具有多分化潛能，可以分化成神經元和神經膠質細胞，在體內可以根據(jù)不同腦區(qū)的微環(huán)境分化成該區(qū)的神經細胞。這種新的細胞具有以下優(yōu)點：①NSCs在腦中能根據(jù)其周圍微環(huán)境的誘導而分裂，分化成相應的細胞類型，其形態(tài)和功能與附近的宿主細胞非常類似，因而能部分補償損傷和死亡細胞的功能；②中樞神經系統(tǒng)具備特殊的結構——血腦屏障，這使得淋巴細胞在正常

5、情況下很難進入，因此不同個體之間，甚至是不同物種之間的NSCs移植都幾乎沒有排異反應，大大拓寬了NSCs的來源；③NSCs可以在體外根據(jù)不同的需要導入相應的外源基因，成為一種廣譜的細胞載體。采用NGF基因修飾NSCs，不僅可利用它對各種神經元的營養(yǎng)作用，而且可利用它維持NSCs的存活，促進NSCs分化，使NSCs移植腦內后能更大限度地補償損傷和死亡的神經元，達到緩解和改善AD癥狀的目的。 目前常用的轉基因載體包括一些病毒載體(如

6、腺病毒等)和陽離子脂質體等，它們各有不同的特點，目前在轉導的細胞中適于作為短時期表達研究。逆轉錄病毒載體由于其結構和生命周期的原因，并由于已經除去了病毒復制所必須的包裝順序而不能復制，只能借助逆轉錄病毒包裝細胞，能穩(wěn)定地將外源基因插入和整合到宿主細胞基因組內，并隨細胞分裂而傳代，提供了一個高效的、穩(wěn)定的、長期的目的基因轉移手段，適于作為基因轉染的載體。 本研究采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法從大鼠海馬組織總RNA擴增N

7、GF基因，構建含NGF基因的重組逆轉錄病毒表達載體，將重組體導入神經干細胞，并進行NGF表達的檢測及其生物活性鑒定，為探討NSCs基因治療AD動物模型奠定基礎。 結論： 1．構建了神經生長因子逆轉錄病毒表達載體pLEGFP-NGF。 2．構建了NGF基因修飾的神經干細胞。 3．基因修飾的神經干細胞能表達NGF 且具有良好的生物學活性。 4．神經干細胞表達的NGF能促進干細胞向神經元細胞和神經膠質細