銅綠假單胞菌噬菌體PaP4的分離鑒定及其基因組序列解析.pdf

1、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)為革蘭氏陰性桿菌,是目前臨床上造成醫(yī)院內感染的最重要的機會致病菌之一。該菌本身對許多抗生素天然不敏感,并且隨著抗生素的大量使用,銅綠假單胞菌對原本敏感的抗生素也產生了耐藥性。因此,在臨床上對銅綠假單胞菌感染的治療,尤其是對多重耐藥菌株感染的治療成為非常棘手的問題。在此背景下,人們把目光轉向了噬菌體的治療潛力。噬菌體是一類廣泛存在于自然界中的可感染細菌的病毒,其數量龐大,約為

2、細菌的10倍(>1031)。據統(tǒng)計,截止到2013年3月,已有921株噬菌體被報道完成全基因組測序。它于1915年由FrederickW.Twort研究發(fā)現,而1919年就將其作為抗菌物質進行實驗研究。之后對于噬菌體的研究一直在繼續(xù),研究者相繼鑒定了多種細菌的不同噬菌體,在噬菌體治療方面也取得了許多顯著成績。然而,噬菌體作為一種抗感染治療手段迄今沒能在臨床推廣應用。就其原因,最重要的是我們對噬菌體這一生命現象的認識還不夠,尤其是對擴展噬

3、菌體宿主譜、提高噬菌體治療制劑的廣譜性方面還缺乏有效突破口。因此,新發(fā)現并鑒定不同的噬菌體仍然是非常重要的工作,這將為噬菌體治療的發(fā)展打下必要的基礎。
　　本文以銅綠假單胞菌的一株臨床分離株PA1作為宿主譜,從西南醫(yī)院的污水中分離到1株噬菌體,命名為PaP4。首先通過最佳感染復數,一步生長曲線和結構蛋白對其生物學特性進行了研究分析;其次提取基因組DNA送至北京華大基因研究中心進行全基因組測序,并通過實驗將噬菌體PaP4的全基因組鑒

4、定為環(huán)狀;進而對基因組進行了初步注釋并提交序列到GenBank。最后通過生物信息學比對分析,證實噬菌體PaP4屬于LUZ24-like噬菌體家族成員。研究內容及結果主要包括以下幾個方面。
　　1.宿主菌銅綠假單胞菌PA1的背景。PA1為新橋醫(yī)院檢驗科分離的臨床分離株,用成都生物制品研究所提供的分群血清鑒定為第11群,本實驗室保存并長期對其進行研究,目前已對其完成了全基因組測序(GenBankNo.CP004054)。
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5、.以銅綠假單胞菌PA1為宿主菌,采用混合宿主菌擴增噬菌體的方法,從西南醫(yī)院污水中分離到1株具有透明噬斑的裂解性噬菌體,命名為PaP4。噬菌體基因組經限制性內切酶酶切鑒定為dsDNA。通過終點滴定法可知該噬菌體滴度為8×1010。樣品染色后,用電鏡觀察發(fā)現PaP4有一個多面體立體對稱的頭部,直徑約為50nm,并有一個約30nm的短尾,形態(tài)學上屬于短尾科噬菌體。由感染復數實驗得出噬菌體PaP4感染其宿主菌PA1的最佳感染復數是0.001。根

6、據一步生長曲線可知,噬菌體PaP4感染宿主菌的潛伏期約為20min,爆發(fā)期約為20min,爆發(fā)量約為150。SDS-PAGE蛋白電泳分析發(fā)現,在中分子量蛋白質標準范圍內,凝膠上至少出現了7條蛋白條帶,表明噬菌體PaP4中至少含有7個結構蛋白。
　　3.將噬菌體PaP4基因組DNA提取純化后送至華大基因北京研究中心對其進行全基因組測序。經BLAST比對檢索,確定噬菌體PaP4為一株全新噬菌體。同時用全覆蓋PCR擴增的方法,確定了其序

7、列的正確性。利用基因組的實際酶切圖譜和電子酶切圖譜的比較方法,最終將PaP4全基因組鑒定為環(huán)狀結構。
　　4.噬菌體PaP4基因組的一般概況。①基因組測序表明該基因組全長為43,895bp,通過軟件分析其堿基組成是:A=24.29％,G=26.44%,C=26.02%,T=23.25%,G+C=52.46%,明顯的低于其宿主菌PA1的G+C含量(66.3%)。②噬菌體PaP4的基因組序列中未發(fā)現tRNA基因。
　　5.基因組

8、的生物信息學分析以及基因功能的探討。噬菌體PaP4全基因組具有264個大于100bp的ORFs,其中70個預測為編碼基因,編碼序列總長度為41,525bp,基因的平均DNA長度為627bp。在整個基因組DNA中,平均每1000bp長度中有1.63個推定基因,基因組中堿基的使用率達到94.6%。使用蛋白質序列對蛋白質序列的比對工具,在國際公共數據庫中發(fā)現了18個同源蛋白質。
　　6.通過基因組比對發(fā)現,噬菌體PaP4全基因組與LUZ

9、24-like家族噬菌體的基因組相似性非常高(92%~76%)。進而,利用MEGA軟件工具對搜索到的具有顯著相似性的基因進行多重比對,通過phylip軟件繪制系統(tǒng)發(fā)生樹,用TreeView軟件觀察結果。并通過CoreGenes的蛋白相關性分析最終證實噬菌體PaP4屬于LUZ24-like噬菌體家族的新成員。
　　噬菌體PaP4的全基因組序列已經在GenBank登錄(No.KC294142)
　　綜上所述,通過本研究,明確了新

10、分離的一株銅綠假單胞菌噬菌體PaP4的基本生物學特性及其全基因組生物信息學特性,并對該基因組進行了初步注釋。PaP4成為繼本室分離鑒定的PaP1,PaP2和PaP3之后的第四株銅綠假單胞菌噬菌體。并通過對這4株噬菌體生物學特性及基因組學特性的比較,進一步揭示了噬菌體的生物多樣性,為全面深入地認識噬菌體的遺傳與變異、進化與分類、基因組織與調控以及寄生機制等生物學特性中的重大問題提供了新的數據。同時,注釋結果表明PaP4屬于LUZ24-li