SERPINs對眼部抗新生血管和抗炎的作用及機制.pdf

1、第一部分:SERPINA3K對大鼠角膜堿燒傷的抗新生血管和抗炎作用
　　 目的:角膜堿燒傷是眼表常見的化學損傷，其特征是引起眼部新生血管和炎癥的急性反應，目前對其病理機制還不十分明了而且缺乏理想的治療方法，所以一直成為眼科面臨的一個十分棘手的難題。本論文旨在探討SERPINA3K對堿燒傷后角膜的新生血管和炎癥的治療，并對其中的可能機制進行研究。
　　 方法:正常成年雄性Wistar大鼠實施角膜堿燒傷后，正常未堿燒傷的大鼠

2、為陰性對照，實驗分為4組:未進行堿燒傷對照組、堿燒傷后PBS處理組、堿燒傷后BSA處理組、堿燒傷后SERPINA3K治療組。每組每只大鼠每天滴眼4次，滴眼劑量為20μg/eye/day，連續(xù)滴眼7天。分別在第1天，第2天，第5天，第8天臨床檢測角膜新生血管面積、炎癥指數(shù)、上皮熒光素鈉染色。組織切片H&E染色觀察角膜病理改變。Western blot檢測角膜新生血管生長因子、色素上皮衍生因子、炎癥因子和表皮生長因子受體即VEGF、PEDF

3、、TNF-α、EGFR的蛋白水平。免疫熒光染色檢測角膜EGFR的表達。MTT細胞存活實驗檢測SERPINA3K對HCE和HUVEC細胞增殖的影響。
　　 結果:發(fā)現(xiàn)對堿燒傷后的大鼠角膜進行SERPINA3K滴眼局部用藥7天，與BSA或者PBS對照組相比，新生血管面積明顯降低。根據(jù)臨床炎癥指數(shù)分析，SERPINA3K組對堿燒傷后角膜炎癥也有抑制作用。SERPINA3K還可增強堿燒傷后角膜上皮的修復作用。其中的可能機制與SERPIN

4、A3K可以調節(jié)促新生血管和抑制新生血管因子的水平，如下調VEGF，上調PEDF有關;SERPINA3K還可抑制炎癥因子TNF-α的水平，并可以明顯提高EGFR在角膜上皮的表達。同時，SERPINA3K抑制HUVEC細胞的增殖，但對HCE細胞的增殖基本沒有影響。
　　 結論:SERPINA3K對堿燒傷后大鼠角膜新生血管和炎癥有治療作用，并對角膜上皮有促修復作用。其中的可能機制與SERPINA3K減低角膜VEGF、TNF-α，上調P

5、EDF、EGFR因子的表達有關。本論文的研究為臨床上治療角膜新生血管提供了新的方向和途徑。
　　 第二部分:SERPINA4對糖尿病視網膜新生血管及炎癥的治療及機制
　　 目的:最近臨床研究發(fā)現(xiàn)在有糖尿病視網膜病變患者的玻璃體中，SERPINA4的表達明顯下降，但在血清中的SERPINA4表達反而升高。本論文旨在研究高表達SERPINA4對糖尿病視網膜病變的作用及其可能的機制。
　　 方法:建立了C57BL/6N

6、J小鼠在視網膜等多器官高表達SERPINA4的轉基因動物模型。利用OIR模型誘導視網膜新生血管，檢測視網膜新生血管面積和視網膜新生血管細胞數(shù)。利用SERPINA4轉基因小鼠與糖尿病Akita小鼠雜交產生的Akita xSERPINA4轉基因小鼠，檢測了視網膜血管內皮粘附的炎癥細胞數(shù)和視網膜血管滲漏。利用Wnt報告基因BAT-gal轉基因小鼠與SERPINA4轉基因小鼠雜交BAT-gal xSERPINA4轉基因小鼠中，檢測了Wnt信號通

7、路在糖尿病視網膜病變中的變化。Western blot檢測LRP6和non-pi-β-catenin在OIR模型和糖尿病模型視網膜中的表達，同時，ELISA檢測VEGF、ICAM-1在以上兩個模型中的表達。利用TOPFLASH檢測SERPINA4對Wnt信號通路的調節(jié)。Western blot檢測SERPINA4對視網膜細胞的pi-LRP6、LRP6、VEGF、TNF-α表達的調節(jié)。免疫共沉淀方法檢測SERPINA4與細胞膜外端LRP6

8、的特定的結合。
　　 結果:在OIR模型中，SERPINA4的高表達可以明顯的減輕視網膜新生血管面積和新生血管細胞數(shù)。在SERPINA4轉基因小鼠與Akita雜交動物模型中，視網膜血管滲漏、血管內皮白細胞粘附、由于高糖引起的VEGF和ICAM-1的過表達均明顯降低。SERPINA4的高表達也抑制由OIR和糖尿病模型引起的Wnt信號通路的激活。在STZ誘導的糖尿病Wnt報告基因鼠BAT-gal與SERPINA4轉基因鼠雜交動物模型

9、中，SERPINA4可以抑制由于糖尿病引起的視網膜的Wnt信號通路的激活。在離體培養(yǎng)視網膜細胞中，SERPINA4可以阻斷由于高糖和Wnt3a誘導的Wnt信號通路的激活。免疫共沉淀和LRP6的結合實驗均顯示SERPINA4可以與Wnt的共受體LRP6有高度的特異結合(Kd=4.5nM)。
　　 結論:本文以OIR和Akita為糖尿病視網膜新生血管模型，解釋了SERPINA4作為內源性配體抑制Wnt信號通路，并且與LRP6結合，下