人可溶性CD83基因的克隆、原核表達、純化及其融合蛋白活性檢測.pdf

1、CD83分子是一個分子量約為40-45kDa大小的糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員[1,2]，其功能還不是完全清楚。CD83分子表達在成熟樹突狀細胞和活化的淋巴細胞表面具有激活免疫效應細胞功能[1-5]?？扇苄问紺D83分子（sCD83）已經被發(fā)現在正常人血清中[6-8]，但是其產生的機制還不是完全清楚。有研究表明sCD83是由膜表面的的CD83分子脫落產生的[8]，最新研究表明sCD83也可以從CD83基因轉錄體選擇剪接產生[9]。同

2、時重組的sCD83蛋白具有強大的抑制混合淋巴細胞反應（MLR）和樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）介導的同種異體T細胞增殖反應作用[10]。在sCD83對C57Bl/6小鼠自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型體內作用研究時，sCD83可以預防和治療EAE的癱瘓癥狀，說明sCD83具有免疫抑制作用[11]。為了解sCD83功能及作用方式，表達并得到其高純度融合蛋白是非常重要的，所以，本試驗設計表達含有6個His標簽的融合蛋白

3、6×His-sCD83，用Ni-NTA親和層析純化，并且檢測融合蛋白體外活性。
　　方法：利用反轉錄PCR（RT-PCR）方法從正常人外周血單個核細胞中獲得可溶性CD83基因，克隆到表達載體pET-32a載體，構成重組質粒,轉化大腸桿菌BL21（DE3）,IPTG誘導表達6×His融合蛋白，并經SDS-PAGE及Western blot檢測和鑒定。表達產物包涵體經Ni-NTA親和層析純化。用混合淋巴細胞反應實驗檢測融合蛋白體外活性

4、。
　　結果：經酶切鑒定及測序證實可溶性CD83蛋白基因的原核表達載體構建正確。經SDS-PAGE及Western blot顯示在相對分子質量約32000處出現融合表達條帶。融合蛋白的表達量約占菌體蛋白總量的45％。重組蛋白經Ni-NTA親和層析進行純化后，得到了高純度的融合蛋白?；旌狭馨图毎磻獙嶒灲Y果表明融合蛋白具有體外活性。
　　結論：成功克隆人外周血單個核細胞來源的可溶性CD83基因片段，并在大腸桿菌BL21（DE3