Fmr1敲除小鼠海馬組織microRNA的差異表達(dá)及其功能研究.pdf

1、背景：脆性X綜合征（Fragile X syndrome，F(xiàn)XS）是常見(jiàn)的遺傳性智力低下疾病，是由位于Xq27.3的脆性X智力低下基因1（fragile X mental retardation1，F(xiàn)MR1）突變引起脆性X智力低下蛋白（fragile X mental retardation protein，F(xiàn)MRP）表達(dá)下降或缺失所致。大部分FXS患者為5′非翻譯區(qū)（CGG）n三核苷酸重復(fù)序列的動(dòng)態(tài)突變，導(dǎo)致其上游CpG島異常甲基化，

2、引起其編碼的FMRP表達(dá)下調(diào)或缺失。極少數(shù)則是由于FMR1有義突變或缺失所致。FMRP通過(guò)作用于mRNA和microRNA（miRNA）在轉(zhuǎn)錄水平選擇性地調(diào)控基因表達(dá)來(lái)參與腦功能的調(diào)控。MiRNAs通過(guò)與mRNAs3′非翻譯區(qū)（3′UTR）以反義序列不完全配對(duì)的形式，抑制mRNA翻譯或促進(jìn)mRNA降解影響蛋白表達(dá)，參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡以及各個(gè)組織器官的正常發(fā)育。近年來(lái)有研究證實(shí)，miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)高表達(dá)，并且某些miRNA已被

3、證實(shí)參與神經(jīng)發(fā)生及腦的發(fā)育。有文獻(xiàn)報(bào)道，在FXS動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)miRNA表達(dá)異常，異常表達(dá)的miRNA通過(guò)形成RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）或其他途徑作用于靶基因mRNA，影響靶基因mRNA的穩(wěn)定性，導(dǎo)致樹(shù)突棘的發(fā)育異常，參與FXS的發(fā)病機(jī)制。已有研究證實(shí)，F(xiàn)MRP在生物化學(xué)以及遺傳學(xué)上與miRNA相關(guān)通路密切聯(lián)系。FMRP，miRNA都具有選擇性的抑制蛋白翻譯的作用，并且FMRP可以與miRNA成熟過(guò)程中的關(guān)鍵Dicer酶相互作

4、用，參與miRNA在胞漿中的成熟過(guò)程。但是，F(xiàn)MRP作為選擇性的RNA結(jié)合蛋白是否在胞核內(nèi)對(duì)miRNA的生成產(chǎn)生影響，異常表達(dá)的miRNA是否參與FXS的發(fā)病，目前尚無(wú)報(bào)道。
　　目的：通過(guò)分析脆性X綜合征動(dòng)物模型-Fmr1敲除（KO）小鼠海馬組織miRNA表達(dá)情況、成熟過(guò)程中pri-miRNA及pre-miRNA的改變，初步探究FMRP對(duì)miRNA成熟過(guò)程可能的影響；并進(jìn)一步分析差異表達(dá)的miRNA對(duì)潛在的靶基因表達(dá)調(diào)控的影響，

5、在基因表達(dá)調(diào)控水平上進(jìn)一步揭示該疾病的發(fā)病機(jī)制。
　　方法：本研究通過(guò)Q-PCR探究Fmr1轉(zhuǎn)錄本在不同發(fā)育時(shí)期小鼠海馬組織中的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況，找到合適研究天數(shù)的小鼠，采用miRNA芯片技術(shù)分析FVB品系野生型小鼠與Fmr1敲除小鼠海馬組織中miRNA表達(dá)譜系在該時(shí)間點(diǎn)的改變情況，對(duì)芯片結(jié)果中差異表達(dá)的miRNA采用熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證，選取改變幅度大于100倍的miRNA，進(jìn)一步觀察其pri-miRNA和pre-miRNA的表達(dá)

6、情況。采用生物信息學(xué)軟件對(duì)上述明顯上調(diào)的miRNA進(jìn)行靶基因的預(yù)測(cè)，采用Gene Ontology分析預(yù)測(cè)到的靶基因，找到與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的基因。采用半定量PCR和熒光定量PCR驗(yàn)證與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的靶基因在WT與KO鼠中轉(zhuǎn)錄本含量有無(wú)差異。構(gòu)建Met3′UTR雙熒光素酶真核報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒和相關(guān)miRNA真核表達(dá)質(zhì)粒，將構(gòu)建的Met3′UTR的質(zhì)粒分別與其相關(guān)的miRNA質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染小鼠神經(jīng)源性N1E115細(xì)胞及Neuro2A細(xì)胞，采用

7、雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)對(duì)共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒雙熒光素酶活性變化進(jìn)行檢測(cè)，分析miRNA對(duì)靶基因3′UTR活性的影響。
　　結(jié)果：⑴通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)不同發(fā)育時(shí)期（從胚胎期18天到出生后60天）小鼠海馬組織中Fmr1的表達(dá)水平。在P1、P7和P15 Fmr1 mRNA表達(dá)水平分別為E18天的0.1、0.6和0.2倍。E18和P60之間表達(dá)無(wú)差異(P>0.05)。毗鄰兩個(gè)發(fā)育時(shí)期之間Fmr1表達(dá)水平有顯著差異（P<0.001）。⑵通過(guò)全基因

8、組miRNA表達(dá)譜系分析顯示，與野生型小鼠相比，P7 KO小鼠在1080種miRNA中有38個(gè)表達(dá)上調(diào)（P<0.001），其中33個(gè)上調(diào)高達(dá)15~250倍；有26個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)約2~4倍（P<0.001）。通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證表達(dá)上調(diào)大于100倍的9個(gè)miRNA，上述miRNA均顯著上調(diào)，與芯片結(jié)果相符。⑶通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)9個(gè)上調(diào)miRNA的pri-miRNA和pre-miRNA的表達(dá)水平。與野生型小鼠相比，9個(gè)pre-m

9、iRNA在KO鼠海馬組織中表達(dá)上調(diào)約5~10倍。而9個(gè)pri-miRNA在KO鼠海馬組織中表達(dá)與野生型小鼠相比未見(jiàn)明顯變化。⑷通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)以及分析上述9個(gè)表達(dá)上調(diào)miRNA的靶基因，有約5000個(gè)潛在的靶基因，其中392個(gè)與神經(jīng)系統(tǒng)功能相關(guān)。392個(gè)靶基因中的絕大多數(shù)只受9個(gè)miRNA中的1個(gè)調(diào)控，小部分靶基因受9個(gè)miRNA中的多個(gè)調(diào)控。對(duì)受其中5~6個(gè)miRNA共同調(diào)控的10個(gè)靶基因，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)mRNA水平，發(fā)現(xiàn)

10、與野生型小鼠相比，上述10個(gè)靶基因mRNA水平在敲除小鼠海馬組織中的表達(dá)均明顯下調(diào)。⑹已預(yù)測(cè)Met3′UTR及調(diào)控其表達(dá)miRNA的相關(guān)信息，構(gòu)建Met3′UTR及其相關(guān)miRNA（miR-34b， miR-340，miR-148a和miR-101a）的質(zhì)粒，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)預(yù)測(cè)的miRNA是否可以通過(guò)作用于Met3′ UTR的序列下調(diào)報(bào)告基因的表達(dá)。將psi-CHECK2-Met3′UTR質(zhì)粒以及相關(guān)的pCMV-EGFP-p

11、re-miRNA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染小鼠神經(jīng)源性N1E-115和Neuro-2A細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-34b，miR-340和miR-148a可以通過(guò)與Met3′UTR的序列相互作用下調(diào)報(bào)告基因的表達(dá)，活性約為陽(yáng)性對(duì)照組的75％-50%。
　　結(jié)論：FMRP可能參與miRNA由pri-miRNA轉(zhuǎn)變?yōu)閜re-miRNA的轉(zhuǎn)錄后加工成熟過(guò)程，選擇性調(diào)控miRNA表達(dá)。KO鼠表達(dá)上調(diào)的miRNA通過(guò)降低靶基因mRNAs的表達(dá)，可能參與FXS的發(fā)病機(jī)