玉米花粉多糖對大鼠腸絨毛微血管內(nèi)皮細(xì)胞幾種免疫相關(guān)因子的影響.pdf

1、本試驗?zāi)康刂荚谔接懹衩谆ǚ鄱嗵?PAM)的免疫增強作用機制，同時借此探討機體免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)的基本工作模式?；痉椒ㄊ潜O(jiān)測大鼠腸絨毛微血管內(nèi)皮細(xì)胞(REC)培養(yǎng)物中受一定濃度的PAM刺激后分泌免疫相關(guān)因子NO、IL-6、ET-1的濃度變化。首先提取PAM并進(jìn)行純化和含量測定。參考植物多糖提取的一般工藝進(jìn)行改進(jìn)，直接使用乙醇回流，然后再使用水提醇沉法。最后通過葡聚糖凝膠柱純化，收集Molish反應(yīng)陽性部分干燥備用。其次培養(yǎng)REC并進(jìn)行純化，用

2、間接免疫熒光法等鑒定均顯示陽性，由此確認(rèn)得到內(nèi)皮細(xì)胞。參考哺乳動物正常血糖水平，設(shè)計PAM原始工作濃度為100μg/ml，約為正常血糖水平的600～1000分之一，實際作用濃度在4～8μg/ml。當(dāng)細(xì)胞層生長達(dá)80﹪時，消化并且收獲細(xì)胞，做細(xì)胞計數(shù)，稀釋到1×105/ml備用。取新細(xì)胞培養(yǎng)板，按照每孔0.5ml進(jìn)行接種，繼續(xù)培養(yǎng)。將預(yù)先升至室溫的PAM溶液按照20μl的設(shè)計加入到各組細(xì)胞培養(yǎng)孔中。按照設(shè)計時間取樣，經(jīng)過3000rpm×5

3、min離心，收取上清液冷凍存放備檢。對樣品中的一氧化氮采用硝酸還原酶法檢測。結(jié)果試驗組中的NO含量在可觀察到的7小時以內(nèi)均明顯高于對照組，而且呈現(xiàn)劑量依賴性，但隨時間延長，NO含量有逐漸下降的趨勢。表明PAM的刺激導(dǎo)致REC分泌NO突然增加，然后逐漸減少；即PAM對REC的作用之一是導(dǎo)致REC分泌NO含量顯著增加。對樣品中的IL-6采用試劑盒ELISA法測定。試驗組仍然明顯高于對照組，且呈現(xiàn)相同的變化規(guī)律。對樣品中ET-1采用試劑盒EL

4、ISA法測定。從第48小時后試驗組均比對照組高，隨時間延長呈明顯上升趨勢。綜合分析試驗結(jié)果，PAM刺激初期，REC呈爆發(fā)式分泌大量NO后逐漸減少NO分泌量；然后分泌較多的IL-6；在持續(xù)大約48小時左右，開始增加分泌ET-1并逐漸加強。從這些細(xì)胞因子的生理作用分析，受PAM刺激后，首先表現(xiàn)為血管壁的擴張，細(xì)胞間隙加大，促進(jìn)炎性反應(yīng)發(fā)生；然后表現(xiàn)為血管壁的收縮，控制漏出液，減輕炎性反應(yīng)程度，即具有免疫增強作用的PAM接觸到REC時會使RE