低氧對(duì)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞巢蛋白表達(dá)的影響及紫草素的干預(yù)作用.pdf

1、目的:
　　1.通過(guò)RNA干擾(RNAi)技術(shù)下調(diào)巢蛋白表達(dá)，探討其對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響研究。
　　2.低氧對(duì)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞巢蛋白表達(dá)的影響。
　　3.研究紫草素(Shikonin)對(duì)低氧大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的干預(yù)作用及其作用機(jī)制。
　　方法:
　　采用酶消化法獲得大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，使用細(xì)胞免疫化學(xué)染色法鑒定細(xì)胞及純度，0.4％臺(tái)盼藍(lán)染色行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。設(shè)計(jì)合成針對(duì)大鼠Nestin基因的

2、特異性siRNA片段，與大鼠Nestin基因序列無(wú)同源性的siRNA-con片段為陰性對(duì)照。將上述2個(gè)片段通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)法轉(zhuǎn)染PASMCs內(nèi)，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR及Western-Blot分別檢測(cè)mRNA及蛋白水平的干擾效率，采用CCK-8染色法檢測(cè)空白對(duì)照組(Blank)，陰性轉(zhuǎn)染組(siRNA-con)及Nestin基因特異性沉默組(siRNA)各組PASMCs的活性，以檢測(cè)的吸光度(Absorbance，A)值大小作為細(xì)胞相對(duì)數(shù)量的比

3、較。采用CCK-8染色法測(cè)定常氧和24小時(shí)低氧情況下PASMCs的活性，及不同濃度紫草素（S，shikonin，1μM，2μM，4μM）對(duì)低氧PASMCs活性的抑制，并選擇合適濃度。把大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分成3組:正常對(duì)照組(N)，24h低氧組(H)，24h低氧+紫草素組(S，紫草素終濃度:4μM)。每次實(shí)驗(yàn)前均用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基饑餓48小時(shí)使細(xì)胞同步化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)各組細(xì)胞Nestin mRN

4、A表達(dá);Western-Blot法檢測(cè)Nestin蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.逆轉(zhuǎn)錄PCR及Westem-Blot顯示，Blank組與siRNA-con組比較，在mRNA及蛋白水平上Nestin的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;與Blank組及siRNA-con組比較，RNAi實(shí)驗(yàn)組中Nestin mRNA及蛋白含量下降，有顯著性差異（P＜0.01）。
　　2.siRNA-con組較Blank組CCK-

5、8的A值稍下降，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);RNAi實(shí)驗(yàn)組較Blank組及siRNA-con組CCK-8的A值顯著下降(P＜0.01)。
　　3.與常氧PASMCs比較，24h低氧情況下PASMCs CCK-8的A值顯著升高(P＜0.01);紫草素濃度為1μM、2μM時(shí)，低氧PASMCs的A值開(kāi)始下降，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;當(dāng)紫草素濃度為4μM時(shí)，對(duì)細(xì)胞活性的抑制率達(dá)19.8％，A值接近于正常值。
　　

6、4.低氧使PASMCs Nestin mRNA及蛋白表達(dá)量升高，與常氧組比較均具有顯著差異(P＜0.01)。
　　5.在低氧狀態(tài)下，加紫草素組PASMCs Nestin mRNA及蛋白含量下降，與低氧組比較有顯著性差異（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.RNAi技術(shù)能下調(diào)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Nestin表達(dá)水平;Nestin具有促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖作用。
　　2.低氧可通過(guò)上調(diào)Nestin的表達(dá)促進(jìn)大鼠肺