內質網分子伴侶Calnexin-Calreticulin輔助埃博拉病毒囊膜糖蛋白成熟機制的研究.pdf

1、埃博拉出血熱（Ebola Hemorrhagic Fever，EHF）是由埃博拉病毒引起的能夠感染人類及其他靈長類動物的高度接觸性傳染病，其主要癥狀為高熱、出血，死亡率高達90％。埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)屬于絲狀病毒科絲狀病毒屬的成員，為單股、負鏈、有囊膜的RNA病毒。其表面的囊膜糖蛋白GP是高度糖基化的蛋白，在介導病毒侵入宿主細胞、誘導機體產生免疫反應等過程中起著關鍵性作用。
　　分子伴侶鈣連蛋白（CNX）

2、、鈣網蛋白（CRT）是存在于內質網中的一類分子，能夠介導糖蛋白的加工和成熟過程。為了研究內質網分子伴侶 CNX、CRT輔助埃博拉病毒囊膜糖蛋白成熟的機制，本試驗首先利用 CRISPR/Cas9技術構建了 CNX、CRT基因敲除的293T細胞系。將表達埃博拉病毒囊膜蛋白 GP mucin區(qū)域缺失基因(GP△MLD)的重組質粒，與囊膜蛋白缺失、表達熒光素酶（Luc）的人免疫缺陷病病毒 I型（HIV-1）基因組的重組質粒共轉染人胚胎腎細胞（2

3、93T），以包裝整合含有埃博拉病毒囊膜蛋白的偽型 EBOV病毒。在293T野生型（WT）、CNX KO、CRT KO、CNX/CRT D.KO的細胞中分別進行轉染，結果顯示在 CNX KO、CRT KO的細胞系上GP△MLD蛋白的表達量和偽型病毒的包裝效率與野生型細胞系相比有所降低，CNX/CRT D.KO細胞系上影響最為明顯。免疫共沉淀實驗顯示 CNX、CRT都會與Flag偶聯的GP△MLD發(fā)生相互作用。該實驗結果表明CNX、CRT在

4、介導埃博拉病毒增殖過程中發(fā)揮關鍵性作用。
　　為了進一步驗證CNX、CRT影響GP△MLD蛋白成熟的作用機制，我們通過點突變的方法將GP△MLD的9個N-鏈接的糖鏈分別缺失后，發(fā)現N563、N618兩點糖鏈的缺失使其在293T細胞中蛋白表達量有所下調，病毒組裝能力及感染力明顯降低。然后將糖鏈進行進一步 N-端依次缺失或者進行組合缺失，結果顯示，N563、N618兩點糖鏈的同時缺失明顯影響了偽型病毒的組裝和感染效率。該結果提示 N5

5、63、N618兩點在維持 GP△MLD的結構和功能方面發(fā)揮關鍵性作用。用Endo H酶消化處理蛋白裂解液，結果顯示N563、N618兩點糖鏈同時缺失的蛋白幾乎全部被Endo H酶消化，由于糖鏈被剪切蛋白分子量變小，而野生型的蛋白則會有GP1蛋白進入高爾基體中從而不能被Endo H酶消化。結果表明N563、N618兩點糖鏈的缺失通過將未成熟的蛋白以 GP0的形式被阻滯在內質網中從而影響了蛋白的切割和進一步的加工過程，進而影響病毒蛋白的生物

6、學功能。更為有意思的是，IP實驗結果顯示， C-端的5個糖鏈缺失后的 GP△MLD與 CNX、CRT的相互作用明顯增強，而 N-端4個糖鏈缺失后的 GP△MLD與 CNX、CRT的相互作用信號較弱。該結果提示C-端的糖鏈在維持GP△MLD蛋白結構和功能方面發(fā)揮重要作用，而 CNX、CRT通過在內質網中阻滯錯誤折疊的 GP蛋白的運輸以此參與調節(jié)蛋白的質量控制系統(tǒng)。
　　為了進一步驗證上述結論在含 mucin區(qū)域的全長 GP蛋白結構中

7、的可行性，我們在全長 GP蛋白中驗證上述結論。結果顯示在 CNX KO、CRT KO上蛋白表達和病毒組裝能力有所降低， CNX/CRT D.KO上降低最明顯。同時，N563、N618兩點糖鏈的缺失使GP蛋白的剪切效率明顯降低，病毒組裝能力和感染力減弱。
　　綜上所述，本課題主要對 CNX、CRT在 GP蛋白糖基化修飾過程中的作用進行相關研究，證明了分子伴侶 CNX、CRT與埃博拉病毒囊膜糖蛋白 GP存在相互作用，缺失會影響 GP的