Fibulin-3在肺癌侵襲轉移中的作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　探討Fibulin-3在非小細胞肺癌(Non-small-cellcarcinoma NSCLC)侵襲轉移中發(fā)揮的作用，并探討其可能的作用機制。
　　方法:
　　1、利用RT-PCR及免疫組織化學方法系統(tǒng)分析Fibulin-3蛋白在肺癌組織和正常肺組織的表達情況，用甲基化特異PCR(MSP)方法檢測Fibulin-3在肺癌中的表觀遺傳失活是否由于啟動子甲基化引起，系統(tǒng)分析其與腫瘤轉移和預后的關聯(lián)。
　

2、　2、構建fibulin-3表達載體轉染入肺癌細胞A549H1299及H460，利用細胞侵襲實驗分析Fibulin-3能否抑制腫瘤細胞侵襲;建立Fibulin-3蛋白穩(wěn)定表達及RNA干擾的細胞系，分析Fibulin-3失活是否促進腫瘤細胞轉移。為了進一步研究Fibulin-3是否由于啟動子甲基化失活而發(fā)揮抑制肺癌細胞侵襲的作用，我們使用兩種Fibulin-3siRNA轉染H1752細胞（缺乏Fibulin-3啟動子甲基化并且表達了正常水

3、平的Fibulin-3蛋白）用transwell檢測其侵襲能力。
　　3、通過RT-PCR和Real-Time PCR檢測轉染Fibulin-3前后A549和H1299細胞中五種TIMP和三種MMP表達水平的變化。免疫組化檢測101例非小細胞肺癌組織中Fibulin-3與MMP-7表達量間的相互關系。通過MSP和免疫組化分析32例腫瘤組織和正常組織中Fibulin-3啟動子甲基化與mmp-7表達量間的關系。
　　4、利用We

4、stern Blot檢測A549和H1299轉染Fibulin-3前后細胞內(nèi)TCF4下游目標蛋白CyelinD1及Myc的表達來分析Fibulin-3是否影響β-catenin/tcf4通路;檢測Fibulin-3是否影響GSK3β活性。
　　5、利用Western Blot檢測A549和H1299轉染Fibulin-3前后細胞核內(nèi)β-catenin含量，間接免疫熒光法檢測Fibulin-3對β-catenin亞細胞定位的影響

5、r>　　6、培養(yǎng)A549和H1299細胞并接種于24孔板中，生長10-24小時（80％匯合度）將報告基因質粒（Fibulin-3或PcDNA3.1）與轉錄因子表達質粒(MMP-7或MMP-7突變體或Lue)共轉染細胞;提取蛋白并用于熒光素酶檢測;加入底物，測定熒光素酶的活性;計算相對熒光強度，并與空載對照比較
　　7、將10只BALB/c裸鼠隨機分為2組，每組5只，通過尾靜脈注射1×106個H460細胞和穩(wěn)定表達Fibulin-3

6、的H460細胞，0.2ml/只。接種7周后將裸鼠以頸椎脫臼法處死，稱重并取肺組織記錄腫瘤結節(jié)數(shù)。
　　結果:
　　1、Real-Time PCR檢測五對匹配的肺癌組織和癌旁組織（病理正常）中Fibulin-3表達量發(fā)現(xiàn)前者較后者Fibulin-3表達量降低。免疫組織化學檢測46例癌旁組織（病理正常）中Fibulin-3陽性率達84％(37of46)而101例肺癌組織中陽性率僅30.7％(31of101)，表明肺癌組織中Fib

7、ulin-3表達量明顯低于正常組織(P＜0.001)。
　　DNA甲基轉移酶5-aza-2'-dC處理六個肺癌細胞株后Real-time PCR檢測到在其中四個細胞中Fibulin-3表達量明顯升高。
　　2、Fibulin-3轉染入A549，H1299和H460后這些細胞的集落形成率較對照組明顯降低，transwell結果顯示穩(wěn)定轉染Fibulin-3的H1299細胞侵襲能力較對照組明顯下降(P＜0.01)。
　　3

8、、Real-Time PCR檢測轉染Fibulin-3前后A549和H1299細胞中五種TIMP和三種MMP表達水平的變化發(fā)現(xiàn)只有mmp7的表達量下降了50％-80％。免疫組化檢測101例非小細胞肺癌組織中Fibulin-3與MMP-7表達量相關性發(fā)現(xiàn)51.4％(52/101)腫瘤組織MMP-7呈陽性，其中60.4％(61/101)的腫瘤表達mmp7或Fibulin-3，但只有10.9％(11/101)同時表達這兩種蛋白，結果具有統(tǒng)計學

9、意義(P＜0.05)。
　　32例組織樣品MSP顯示其中有12例Fibulin-3基因發(fā)生甲基化，在這12例中有10例mmp7蛋白表達是陽性的(83.3％)，而Fibulin-3基因未發(fā)生甲基化的20例組織樣本中只有8例mmp7蛋白表達逞陽性(40％)。
　　4、Fibulin-3明顯抑制A549和H1299細胞中c-myc和Cyclin D1的表達，進一步的分析顯示，F(xiàn)ibulin-3刺激后糖原合成酶激酶3β(GSK3β)

10、的磷酸化水平升高。
　　5、間接免疫熒光法用于分析轉染FBL3前后直腸癌SW480細胞（細胞核內(nèi)含有豐富的β-catenin）中β-catenin定位變化。結果表明，F(xiàn)ibulin-3轉染細胞后細胞核內(nèi)β-catenin的含量較對照組明顯降低，GSK3β參與β-catenin從細胞質入核的過程。
　　6、Fibulin-3是經(jīng)由β-catenin/tcf4信號通路發(fā)揮抑制肺癌侵襲作用，我們發(fā)現(xiàn)在A549和H1299細胞中轉染

11、Fibulin-3，明顯抑制tcf4報告基因的活性。Fibulin-3通過野生型β-catenin以及突變的β-catenin(去除降解所需的N-末端的磷酸化位點(△N))都能抑制TCF-4報告基因的轉錄。β-catenin/TCF-4直接綁定到MMP-7的啟動子區(qū)域TBE區(qū)，以驅動其轉錄激活作用，F(xiàn)ibulin-3可以抑制這一過程。
　　7、7周后，接種H460細胞的裸鼠肺轉移結節(jié)明顯多于接種Fibulin-3-H460細胞的裸