南蛇藤有效部位對SGC-7901、Hela細胞增殖抑制及誘導凋亡的實驗研究.pdf

1、細胞凋亡是指為維持內環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。凋亡是多基因嚴格控制的過程，這些基因在種屬之間非常嚴密，如Bc1-2家族、caspase家族、抑癌基因P53、癌基因C-myc等。從細胞凋亡這一新視角來看中醫(yī)藥抗腫瘤作用，對于從分子水平揭示中藥的作用機制，篩選新的抗癌中藥具有十分重要的意義。 南蛇藤(Celastrus orbiculatus)為衛(wèi)矛科南蛇藤(celastrus)屬植物，分布廣泛，其藤莖、根、葉、果

2、均可入藥。現(xiàn)代藥物化學研究證實南蛇藤某些成分(如倍半萜烯酯類)具有較強的抗腫瘤活性。在現(xiàn)階段，國內外對南蛇藤的系統(tǒng)抗癌活性及機理研究均無相關報道。本課題是從體外對南蛇藤有效部位抑制腫瘤細胞增殖及誘導其凋亡作用的相關研究，為南蛇藤的進一步研究開拓思路。 1．目的： 研究南蛇藤乙酸乙酯、正丁醇提取物體外抑制腫瘤細胞增殖，確定南蛇藤有效部位具有誘導細胞凋亡作用，初步揭示其誘導腫瘤細胞凋亡的途徑，為南蛇藤應用于開發(fā)研究奠定基礎。

3、 2．方法： 2.1 MTT法采用四氮唑鹽(MTT)還原法測定南蛇藤乙酸乙酯、正丁醇提取物的體外抑瘤率。以同一提取部位的不同濃度對人胃癌SGC-7901細胞、人子宮頸癌細胞-Hela抑制率作圖得到劑量-效應圖譜。 2.2 雙熒光標記法-A0/EB采用吖啶橙(A0)/溴化乙啶(EB)雙熒光染色及熒光顯微鏡觀察經(jīng)南蛇藤乙酸乙酯、正丁醇提取物作用后的人胃癌SGC-901細胞、人子宮頸癌細胞-Hela中凋亡細胞形態(tài)。 2

4、.3 FITC-Annexin V與PI雙染色法采用流式細胞術檢測南蛇藤乙酸乙酯、正丁醇提取物作用于人胃癌SGC-7901細胞、人子宮頸癌細胞-Hela后的凋亡細胞數(shù)。 2.4 流式細胞術檢測抑癌基因-P53蛋白采用流式細胞術，通過間接熒光標記法測定SGC-7901細胞、Hela細胞中P53蛋白變化。P53蛋白熒光指數(shù)(Fluoresence Index，F(xiàn)I)表示定量的P53蛋白。綠熒光LOG收集的熒光強度峰值數(shù)轉化成線性刻度

5、，對照管作為陰性表達FI=1。FI計算公式如下：FI=檢測管細胞平均熒光強度/對照管細胞平均熒光強度。如FI>1.0為陽性表達，F(xiàn)I≤1.0為陰性表達。 2.5 細胞免疫組化采用細胞免疫組化S-P染色法檢測人胃癌SGC-7901細胞、人子宮頸癌細胞中P53蛋白陽性表達率。 3．結果： 3.1 4個濃度的南蛇藤乙酸乙酯、正丁醇提取物(15、30、60、120μg/ml)對SGC-7901、Hela細胞均有一定的抑制

6、作用，且呈劑量依賴性。經(jīng)統(tǒng)計學分析差異均有顯著性(P<0.01)。 3.2 SGC-7901、Hela細胞經(jīng)南蛇藤乙酸乙酯、正丁醇提取物作用后，根據(jù)流式細胞術圖譜，F(xiàn)ITC+/PI-為凋亡細胞。不同濃度的南蛇藤提取物作用24h后，凋亡細胞比例明顯升高，且呈劑量依賴關系(P<0.01)。 3.3 利用流式細胞免疫熒光技術檢測P53基因產(chǎn)物，隨著藥物濃度的增加，P53峰總體向右偏移。根據(jù)FI計算公式計算出FI值，經(jīng)南蛇藤乙酸

7、乙酯、正丁醇提取物作用24h后，P53均陽性表達，且FI值隨劑量的增加而增高。 3.4 熒光顯微鏡觀察到EB為紅色，只能染色死亡細胞核。正常活細胞胞膜完整，EB不能滲透，細胞核不能染色。A0為綠色，可用于染色活細胞。 對照組可見整個細胞為綠色，說明為正?；罴毎＝?jīng)南蛇藤乙酸乙酯、正丁醇提取物作用后，整個細胞背景為綠色，細胞膜較完整，細胞核中紅色和綠色重合時為橘紅色，細胞核呈固縮狀或圓珠狀，即為細胞凋亡時的形態(tài)學改變(凋亡小體)。