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文檔簡介
1、目的:JNK信號轉(zhuǎn)導通路在細胞應激反應中起著重要的作用,并且能被多種細胞外應激信號激活,所以JNK也被稱為應激活化蛋白激酶(stress activated protein kinase,SAPK)。當機體受到刺激后,JNK能迅速地聚集在細胞核中,導致相應基因表達的改變,引起機體發(fā)生一系列改變。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),蛋白激酶介導細胞信號轉(zhuǎn)導在腦缺血預處理中起到重要的調(diào)控作用。
腦缺血預處理的效應分為早期效應和延遲效應,早期效
2、應發(fā)生于預處理后數(shù)小時,其機制與心肌缺血預處理機制相似,主要與腺苷受體激活和KATP通道開放有關;延遲效應在預處理后2-4天達高峰,與諸多基因表達的增強或受抑制有關。但是,腦缺血預處理誘發(fā)缺血耐受的機制十分復雜,目前仍不十分清楚,因此大量的國內(nèi)外學者在致力于此方面的研究。
本實驗旨在探討JNK在全腦缺血大鼠海馬中的表達,觀察三分鐘全腦缺血對JNK蛋白的表達的影響,探討JNK在短暫腦缺血后表達的變化。
方法:<
3、br> 將40只預先凝閉雙側(cè)椎動脈的雄性Wistar大鼠(270-320g)隨機分為8組:①全腦缺血組(n=5):夾閉雙側(cè)頸總動脈3 min造成全腦缺血后即刻取材;②再灌注15min組(n=5):夾閉雙側(cè)頸總動脈3 min后,恢復血流再灌注15min;③再灌注30min組(n=5):夾閉雙側(cè)頸總動脈3 min后,恢復血流再灌注30min;④再灌注3h組(n=5):夾閉雙側(cè)頸總動脈3 min后,恢復血流再灌注3h;⑤再灌注1d組(n
4、=5):夾閉雙側(cè)頸總動脈3 min后,恢復血流再灌注1d;⑥再灌注2d組(n=5):夾閉雙側(cè)頸總動脈3 min后,恢復血流再灌注2d;⑦再灌注4d組(n=5):夾閉雙側(cè)頸總動脈3 min后,恢復血流再灌注4d:⑧再灌注7d組(n=5):夾閉雙側(cè)頸總動脈3 min后,恢復血流再灌注7d。各組動物于規(guī)定的時間點斷頭取海馬組織,制成5μm厚的石蠟切片,用于以下實驗:1硫堇染色進行神經(jīng)病理學評價;2免疫組化檢測JNK蛋白的表達;3免疫組化檢測p
5、-JNK蛋白的表達。
參照Kato分級方法,于光學顯微鏡下對海馬CA1區(qū)組織學改變進行分級(Histological grade,HG),標準如下:0級,無神經(jīng)元死亡;1級,散在神經(jīng)元死亡;2級,成片神經(jīng)元死亡;3級,幾乎全部的神經(jīng)元死亡。取雙側(cè)平均等級作為統(tǒng)計值。高倍鏡下計數(shù)海馬CA1區(qū)每1 mm區(qū)段內(nèi)細胞膜完整、胞核飽滿、核仁清晰的錐體細胞數(shù)目,每張切片雙側(cè)海馬各計數(shù)3個區(qū)段,取平均數(shù)為神經(jīng)元密度(Neuronal d
6、ensity,ND)。
結(jié)果:
1、神經(jīng)病理學評價
全腦缺血組中,海馬CA1區(qū)無椎體神經(jīng)元的死亡。錐體細胞排列整齊,無細胞缺失,細胞形態(tài)完整,胞核大而圓,位于細胞中央,核仁清晰,尼氏體豐富。再灌注15min、30min、3h、1d、2d、4d、7d組與全腦缺血組基本一致,未見明顯的神經(jīng)元損傷,亦無細胞缺失。
全腦缺血組中,海馬CA3區(qū)錐體細胞排列比較整齊,細胞形態(tài)完整,胞核大而圓,
7、位于細胞中央,核仁清晰,有個別的死亡的錐體細胞體積縮小,呈三角形或不規(guī)則形,深染。再灌注15min、30min、3h、1d、2d、4d、7d組與全腦缺血組基本一致,未見明顯差異。
2、JNK蛋白的表達
低倍鏡下,海馬的輪廓清晰,可見大量深染的棕黃色的神經(jīng)細胞。
高倍鏡下,可見海馬的各區(qū)即CA1區(qū)、CA3區(qū)、CA4及齒狀回的細胞均表達大量棕黃色陽性物,細胞呈圓形或橢圓形,大小較均一。與全腦缺血組相
8、比,再灌注各組的積分光密度在大鼠海馬各區(qū)均無統(tǒng)計學差異(數(shù)據(jù)未顯示)。
3、p-JNK蛋白的表達
全腦缺血組中,海馬CA1區(qū)幾乎無免疫陽性物質(zhì)表達。與全腦缺血組比較,再灌注15min、30min、3h組海馬CA1區(qū)有很少量的陽性物,但無明顯的統(tǒng)計學差異;再灌注1d組明顯高于全腦缺血組;隨后的再灌注2d、4d、7d組與全腦缺血組比較無統(tǒng)計學差異。
全腦缺血組中,海馬CA3區(qū)有很少量的椎體神經(jīng)元表達
9、p-JNK蛋白。再灌注15min、30min、3h、1d和2d組,部分細胞胞漿呈p-JNK蛋白陽性,個別細胞胞核為p-JNK蛋白陽性。再灌注15min、30min、3h、1d和2d的積分光密度有所升高,但與全腦缺血組相比無統(tǒng)計學差異。再灌注4d和7d組,海馬CA3區(qū)椎體神經(jīng)元中p-JNK蛋白表達量較少。
結(jié)論:
1、3min全腦缺血再灌注后,海馬CA1、CA3區(qū)未見明顯神經(jīng)細胞死亡。
2、3mi
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