JNK在全腦缺血再灌注大鼠海馬中的表達(dá).pdf

1、目的：JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中起著重要的作用，并且能被多種細(xì)胞外應(yīng)激信號激活，所以JNK也被稱為應(yīng)激活化蛋白激酶（stress activated protein kinase，SAPK）。當(dāng)機(jī)體受到刺激后，JNK能迅速地聚集在細(xì)胞核中，導(dǎo)致相應(yīng)基因表達(dá)的改變，引起機(jī)體發(fā)生一系列改變。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶介導(dǎo)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在腦缺血預(yù)處理中起到重要的調(diào)控作用。
　　 腦缺血預(yù)處理的效應(yīng)分為早期效應(yīng)和延遲效應(yīng)，早期效

2、應(yīng)發(fā)生于預(yù)處理后數(shù)小時(shí)，其機(jī)制與心肌缺血預(yù)處理機(jī)制相似，主要與腺苷受體激活和KATP通道開放有關(guān)；延遲效應(yīng)在預(yù)處理后2-4天達(dá)高峰，與諸多基因表達(dá)的增強(qiáng)或受抑制有關(guān)。但是，腦缺血預(yù)處理誘發(fā)缺血耐受的機(jī)制十分復(fù)雜，目前仍不十分清楚，因此大量的國內(nèi)外學(xué)者在致力于此方面的研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在探討JNK在全腦缺血大鼠海馬中的表達(dá)，觀察三分鐘全腦缺血對JNK蛋白的表達(dá)的影響，探討JNK在短暫腦缺血后表達(dá)的變化。
　　 方法：<

3、br>　　 將40只預(yù)先凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈的雄性Wistar大鼠（270-320g）隨機(jī)分為8組：①全腦缺血組（n=5）：夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3 min造成全腦缺血后即刻取材；②再灌注15min組（n=5）：夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3 min后，恢復(fù)血流再灌注15min；③再灌注30min組（n=5）：夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3 min后，恢復(fù)血流再灌注30min；④再灌注3h組（n=5）：夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3 min后，恢復(fù)血流再灌注3h；⑤再灌注1d組（n

4、=5）：夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3 min后，恢復(fù)血流再灌注1d；⑥再灌注2d組（n=5）：夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3 min后，恢復(fù)血流再灌注2d；⑦再灌注4d組（n=5）：夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3 min后，恢復(fù)血流再灌注4d：⑧再灌注7d組（n=5）：夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3 min后，恢復(fù)血流再灌注7d。各組動(dòng)物于規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)斷頭取海馬組織，制成5μm厚的石蠟切片，用于以下實(shí)驗(yàn)：1硫堇染色進(jìn)行神經(jīng)病理學(xué)評價(jià)；2免疫組化檢測JNK蛋白的表達(dá)；3免疫組化檢測p

5、-JNK蛋白的表達(dá)。
　　 參照Kato分級方法，于光學(xué)顯微鏡下對海馬CA1區(qū)組織學(xué)改變進(jìn)行分級（Histological grade，HG），標(biāo)準(zhǔn)如下：0級，無神經(jīng)元死亡；1級，散在神經(jīng)元死亡；2級，成片神經(jīng)元死亡；3級，幾乎全部的神經(jīng)元死亡。取雙側(cè)平均等級作為統(tǒng)計(jì)值。高倍鏡下計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)每1 mm區(qū)段內(nèi)細(xì)胞膜完整、胞核飽滿、核仁清晰的錐體細(xì)胞數(shù)目，每張切片雙側(cè)海馬各計(jì)數(shù)3個(gè)區(qū)段，取平均數(shù)為神經(jīng)元密度（Neuronal d

6、ensity，ND）。
　　 結(jié)果：
　　 1、神經(jīng)病理學(xué)評價(jià)
　　 全腦缺血組中，海馬CA1區(qū)無椎體神經(jīng)元的死亡。錐體細(xì)胞排列整齊，無細(xì)胞缺失，細(xì)胞形態(tài)完整，胞核大而圓，位于細(xì)胞中央，核仁清晰，尼氏體豐富。再灌注15min、30min、3h、1d、2d、4d、7d組與全腦缺血組基本一致，未見明顯的神經(jīng)元損傷，亦無細(xì)胞缺失。
　　 全腦缺血組中，海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞排列比較整齊，細(xì)胞形態(tài)完整，胞核大而圓，

7、位于細(xì)胞中央，核仁清晰，有個(gè)別的死亡的錐體細(xì)胞體積縮小，呈三角形或不規(guī)則形，深染。再灌注15min、30min、3h、1d、2d、4d、7d組與全腦缺血組基本一致，未見明顯差異。
　　 2、JNK蛋白的表達(dá)
　　 低倍鏡下，海馬的輪廓清晰，可見大量深染的棕黃色的神經(jīng)細(xì)胞。
　　 高倍鏡下，可見海馬的各區(qū)即CA1區(qū)、CA3區(qū)、CA4及齒狀回的細(xì)胞均表達(dá)大量棕黃色陽性物，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，大小較均一。與全腦缺血組相

8、比，再灌注各組的積分光密度在大鼠海馬各區(qū)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（數(shù)據(jù)未顯示）。
　　 3、p-JNK蛋白的表達(dá)
　　 全腦缺血組中，海馬CA1區(qū)幾乎無免疫陽性物質(zhì)表達(dá)。與全腦缺血組比較，再灌注15min、30min、3h組海馬CA1區(qū)有很少量的陽性物，但無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；再灌注1d組明顯高于全腦缺血組；隨后的再灌注2d、4d、7d組與全腦缺血組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 全腦缺血組中，海馬CA3區(qū)有很少量的椎體神經(jīng)元表達(dá)

9、p-JNK蛋白。再灌注15min、30min、3h、1d和2d組，部分細(xì)胞胞漿呈p-JNK蛋白陽性，個(gè)別細(xì)胞胞核為p-JNK蛋白陽性。再灌注15min、30min、3h、1d和2d的積分光密度有所升高，但與全腦缺血組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。再灌注4d和7d組，海馬CA3區(qū)椎體神經(jīng)元中p-JNK蛋白表達(dá)量較少。
　　 結(jié)論：
　　 1、3min全腦缺血再灌注后，海馬CA1、CA3區(qū)未見明顯神經(jīng)細(xì)胞死亡。
　　 2、3mi