新型天然產(chǎn)物EPLE抗結(jié)直腸癌及NMHC抗白血病的作用和機制研究.pdf

1、第一部分新型對映貝殼杉烷型二萜EPLE抗結(jié)直腸癌的作用及機制研究
　　目的：結(jié)直腸癌是目前發(fā)病率極高的惡性腫瘤。盡管早期結(jié)直腸癌通過外科切除可取得較好的療效，但由于遠端轉(zhuǎn)移的晚期結(jié)直腸癌化療、放療效果都不明顯，目前仍沒有理想的治療方法。Wnt/β-catenin信號通路的異常激活與結(jié)直腸癌的發(fā)生有著密切關(guān)系，這一部分工作研究從貴州鼠尾草中分離得到的對映貝殼杉烷型二萜類新型小分子化合物（EPLE）通過調(diào)控Wnt/β-catenin信

2、號通路發(fā)揮抗結(jié)直腸癌的作用及其機制。
　　方法：以多種結(jié)直腸癌細胞株、患者原代樣本和小鼠異源移植模型為研究對象，采用細胞生物學與分子生物學技術(shù)，研究EPLE抗腫瘤的機制。采用MTT法及軟瓊脂克隆實驗檢測化合物對多種結(jié)直腸癌細胞的毒性作用；運用流式細胞技術(shù)和免疫印跡法檢測細胞周期和凋亡以及相關(guān)蛋白的表達水平變化，熒光定量PCR技術(shù)檢測Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因的mRNA表達水平變化；構(gòu)建雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測

3、Wnt/β-catenin信號通路的活性變化。我們還采用免疫共沉淀的方法檢測EPLE對β-catenin/TCF4轉(zhuǎn)錄復合物形成的阻斷作用；計算機模擬EPLE阻斷β-catenin/TCF4相互作用的結(jié)構(gòu)圖示。體內(nèi)實驗中通過裸鼠結(jié)直腸癌細胞移植瘤模型，檢測EPLE對移植瘤生長、腫瘤細胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響。
　　結(jié)果： EPLE可特異性抑制人結(jié)直腸癌細胞系及原代腫瘤樣本的增殖而對正常結(jié)腸上皮細胞增殖無明顯抑制作用且呈良好的

4、劑量及時間依賴性。EPLE可誘導結(jié)直腸癌細胞發(fā)生凋亡。機制研究顯示EPLE直接靶向Wnt/β-catenin信號通路，阻斷β-catenin/TCF4復合物的形成，抑制β-catenin轉(zhuǎn)錄激活下游靶基因的表達。EPLE與現(xiàn)有的結(jié)直腸癌化療藥物五氟尿嘧啶聯(lián)合使用具有一定的協(xié)同作用，而且單獨使用即可抑制結(jié)直腸癌移植瘤小鼠模型的腫瘤生長，并誘導體內(nèi)腫瘤細胞發(fā)生凋亡。
　　結(jié)論：EPLE對結(jié)直腸癌細胞具有顯著而特異性的細胞毒作用，通過直

5、接抑制Wnt/β-catenin信號通路，阻斷β-catenin與TCF4的相互作用，抑制TCF4/?-catenin轉(zhuǎn)錄復合物的活性，而發(fā)揮其抗腫瘤作用。
　　第二部分新型石蒜科生物堿NMHC抗急性髓細胞白血病的作用及機制研究
　　目的：急性髓細胞白血病(AML)表現(xiàn)為骨髓中造血干細胞的惡性增殖，是一種常見的惡性血液腫瘤，近年來盡管聯(lián)合化療和造血干細胞移植取得了較大的進展,但大多數(shù)患者仍然死于耐藥、復發(fā)或并發(fā)癥，因此臨床急

6、需尋找更加有效的治療藥物。最新病理機制研究表明 NOTCH信號通路的激活在 AML中表現(xiàn)為腫瘤抑制的活性。本實驗主要研究石蒜科蔥蓮屬植物蔥蓮中提取的生物堿NMHC對AML的抗腫瘤藥效及其作用機制，可能為將來有效治療AML提示新思路。
　　方法：以多種白血病細胞系為研究對象，采用CCK8法檢測受試藥物NMHC對白血病細胞的毒性，流式細胞技術(shù)與蛋白質(zhì)印跡法檢測 NMHC對AML細胞周期和凋亡的影響。為深入探索化合物誘導白血病細胞凋亡的

7、分子機制，我們進行了全基因組表達譜基因芯片分析和KEGG信號通路基因的富集分析，并通過熒光定量 PCR、雙熒光素酶報告基因和免疫印跡的方法驗證 NMHC處理后NOTCH1靶基因的表達變化。進一步在AML細胞中穩(wěn)定表達MAML的負顯性形式DNMAML以專一性的阻斷NOTCH信號，通過追蹤GFP表達百分比檢測內(nèi)源性阻斷NOTCH能否能挽救NMHC引起的細胞凋亡。
　　結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)受試藥物NMHC可顯著抑制髓系細胞白血病的增殖并誘導細

8、胞凋亡，而對淋巴細胞白血病的毒性較弱。全基因組表達譜分析發(fā)現(xiàn)，NMHC處理后NOTCH信號通路的相關(guān)基因明顯上調(diào)，提示NMHC能激活NOTCH信號通路。后續(xù)實驗證實，NMHC可有效促進 NOTCH下游靶基因的表達，增強活性形式ICN的蛋白表達，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果表明NMHC處理后能直接激活I(lǐng)CN的轉(zhuǎn)錄。而且，NMHC與NOTCH激活多肽DLL4聯(lián)用對下游靶基因的激活具有協(xié)同作用，通過表達負顯性形式DNMAML阻斷NOTCH信號通