轉染抑癌基因KLF6對前列腺癌PC-3細胞作用的實驗研究.pdf

1、近來發(fā)現野生型抑癌基因KLF6在前列腺癌中的突變率高達77％，且有高度特異性。本研究克隆了野生型KLF6基因，將其重組質粒轉染入前列腺癌PC-3細胞，觀察了KLF6對PC-3細胞生長增殖、細胞周期、對Bcl-2和CyclinD1蛋白表達的影響等，分四個部分簡述如下。 第一部分：抑癌基因KLF6的克隆及質粒的構建【目的】從正常人體中提取總RNA，利用RT-PCR法反應獲得目的基因野生型KLF6的cDNA片斷，構建具備可進行細胞轉染

2、和容易被識別篩選的KLF6-pEGFP-C1質粒載體。 【材料和方法】應用Trizol法從人體正常肝臟細胞中提取mRNA，按GeneBank公布的野生型KLF6基因序列及文獻設計引物序列：5’端引物：5’-AAGGTACCATGGACGTGCTCCCTATGTGC-3’;3’端引物：5’-CGTCTAGATCAGAGGTGCCTCTTCATGTG-3’。RT-PCR反應在94℃1min,60℃1.5min，72℃2min，最后在

3、72℃延伸8min條件下進行30個循環(huán)，獲得852bp大小的野生型KLF6的cDNA片段pKLF6。pKLF6用內切酶BamHI和EcoRI雙酶切，真核表達載體pEGFP-C1同樣用BamHI和EcoRI雙酶切，二者進行連接反應，構建包含目的基因KLF6的重組質粒pEGFP-C1-KLF6。 【結果】使用Trizol法分離和提取得到正常人體的總RNA，通過RT-PCR法反應獲得目的基因野生型、KLF6的cDNA片斷，構建完成了能

4、夠穩(wěn)定表達和具有篩選特征的KLF6-pEGFP-C1質粒載體，使其成為可進行細胞轉染和易被識別的穿梭質粒，供后續(xù)轉染和表達實驗使用。 【結論】Trizol法簡便快速地提取到正常人體的總RNA，RT-PCR法反應準確地獲得目的基因野生型KLF6的cDNA片斷，正確構建完成的KLF6-pEGFP-C1質粒載體，具備進行細胞轉染和易被識別和篩選的特點。 第二部分：脂質體介導重組KLF6質粒的轉染和PC-3細胞的培養(yǎng)篩選【目的】

5、對重組KLF6-pEGFP-C1質粒載體進行擴增，以達到實驗所需要的數量并進行純化。將重組KLF6-pEGFP-C1質粒載體轉染入雄激素非依賴性前列腺癌PC-3細胞中，篩選出陽性細胞克隆。 【材料和方法】制備感受態(tài)細菌E.coliDH5a，加入含KLF6的重組pEGFP-C1質粒DNA溶液，加入LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)1小時，取100μl接種于含Amp的篩選平板上，37℃培養(yǎng)出現明顯而又未相互重疊的單菌落，收獲并以堿裂解法

6、抽提質粒DNA并純化，用限制性內切酶KpnI和XbaI酶切，電泳檢驗。在37℃含5％CO2的條件下，含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中進行PC-3細胞的傳代培養(yǎng)。采用脂質體LipofectAMINE2000介導質粒pEGFP-C1-KLF6在PC-3細胞處于對數生長期時進行轉染，調整細胞濃度至1×106/ml，按每孔1×106細胞接種于24孔培養(yǎng)板。配制脂質體和pEGFP-C1-KLF6的混合物，在細胞培養(yǎng)箱中轉染1小時，再置

7、換含10％小牛血清的完全培養(yǎng)基1ml進行培養(yǎng)。熒光顯微鏡檢查轉染后的PC-3細胞，并采用含G418的培養(yǎng)基篩選以獲得陽性克隆的整合了KLF6基因的PC-3細胞，繼續(xù)傳代培養(yǎng)6周，收獲細胞懸液或取其細胞爬片待用。 【結果】重組質粒經過選擇性培養(yǎng)，出現了明顯的未相互重疊的陽性單菌落，在含Amp的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)擴增，達到了足夠的數量。使用堿裂解法抽提質粒DNA并純化，經電泳再次檢驗與擴增前重組KLF6-pEGFP-C1質粒位

8、置相同。轉染后經熒光顯微鏡檢查可見成功轉染了KLF6-pEGFP-C1表達綠色熒光蛋白的陽性表達細胞，并采用G418篩選獲得足夠數量陽性克隆的含野生型KLF6的PC-3細胞。 【結論】通過感受態(tài)細菌的轉化、擴增、收集、裂解，分離和純化重組KLF6-pEGFP-C1質粒DNA，獲得了足夠數量的重組KLF6-pEGFP-C1質粒。轉染KLF6-pEGFP-C1質粒獲得陽性表達細胞，篩選獲得足夠數量陽性克隆的包含野生型KLF6的PC-

9、3細胞。 第三部分：轉染抑癌基因KLF6后對PC-3細胞生長抑制和細胞周期的影響【目的】研究和探討轉染野生型KLF6后，PC-3細胞的生長是否會受到抑制，是否會有顯著的細胞凋亡出現，探討野生型KLF6是否會影響PC-3的細胞周期進展和分布比例，以判斷KLF6在前列腺癌的發(fā)生和進展方面是否扮演著關鍵性的作用，進而說明KLF6是否是前列腺癌病因學中的一個重要抑癌基因，同時探討野生型KLF6是否可用于激素非依賴性前列腺癌的治療。

10、 【材料和方法】將5×106/L的未轉染KLF6和轉染后的PC-3細胞接種于96孔板，貼壁生長48h后棄上清，加入200μl新配制的5g/L濃度的MTT，37℃孵育4h，棄上清加入150u1的二甲基亞砜(DMSO)，混勻后于酶標儀在490nm波長測定吸光度(A)。細胞生長抑制率=(1-實驗孔測定值/對照孔測定值)×100％。將細胞消化分離為1×106/ml的單細胞懸液，離心沉淀，PBS液洗滌3次，70％乙醇固定30min，1％Trit

11、onX-10010ml處理10min，1×10-4kg/L的Rnase1ml處理10min，2.5×10-3kg/L碘化丙錠染色30min，流式細胞儀分析轉染前后細胞DNA含量變化和凋亡情況?！窘Y果】MTT法觀察顯示，轉染野生型KLF6基因后的PC-3細胞生長抑制率為(30.0±5.4)％，對照組=(10.6±1.2)％，兩組比較P＜0.01，轉染后PC-3細胞生長增殖受到明顯的抑制。流式細胞儀定量檢測表明轉染野生型KLF6基因48h后

12、，PC-3細胞出現較為明顯的凋亡峰，Ap峰=(24.3±2.3)％，與對照組(5.2±0.7)％比較有顯著差異(P＜0.01)，說明轉染野生型KLF6誘導了PC-3細胞凋亡的出現，。轉染野生型KLF6基因48小時后的PC-3細胞的細胞周期中G0/G1期占(76.0±9.8)％，對照組=(58.6±7.3)％，兩組比較P＜0.01，顯示細胞周期阻滯以G0/G1期為主，同時S期和G2/M期細胞比例顯著減少。 【結論】轉染野生型KLF

13、6后PC-3細胞的生長增殖受到顯著的抑制，說明轉染野生型KLF6后抑制了PC-3細胞的過度增殖。轉染后PC-3細胞的G0/G1期比例增加，S期和G2/M期比例減少，說明抑野生型KLF6主要將PC-3的細胞周期阻滯在G0/G1期。野生型KLF6通過阻滯PC-3的細胞周期進展，部分地逆轉了PC-3細胞的惡性表型，并且誘導前列腺癌PC-3細胞的凋亡，可以起到治療激素非依賴性前列腺癌的作用。 第四部分：轉染抑癌基因KLF6對PC-3細胞

14、Bcl-2和CyclinD1蛋白表達影響【目的】探討轉染了野生型KLF6后的前列腺癌PC-3細胞中CyclinD1和bcl-2蛋白的表達是否會受到影響，并探討其表達的變化與KLF6的作用及其機理和途徑之間的關系。 【材料和方法】采用免疫細胞化學方法檢測bcl-2和CyclinD1蛋白的表達。對照組和轉染組PC-3細胞爬片經Hank's液漂洗，丙酮固定10min，乙醇脫片及漂洗后，選用含鼠抗人單克隆抗體為第一抗體(1：100)，生

15、物素標記第二抗體(1：100)的即用型SP試劑盒，依次按UltraSensitiveS-P免疫組化染色步驟染色，以出現明顯DAB棕黃色者判斷為陽性表達。 【結果】轉染野生型抑癌基因KLF6后的PC-3細胞中bcl-2蛋白的表達率為(18.7±3.2)％，對照組=(41.8±5.9)％，兩組比較P＜0.05。轉染野生型抑癌基因KLF6后的PC-3細胞中CyclinD1蛋白的表達率為(25.3±3.7)％，對照組=(38.5±4.6

16、)％,兩組比較P＜0.05。轉染了抑癌基因KLF6后的前列腺癌PC-3細胞較未轉染抑癌基因KLF6的前列腺癌PC-3細胞，CyclinD1和bcl-2蛋白的表達發(fā)生了顯著下調。 【結論】抑癌基因KLF6的表達可以下調前列腺癌PC-3細胞中CyclinD1和bcl-2蛋白的表達，結合流式細胞檢測的細胞凋亡率結果，提示KLF6很可能通過下調CyclinD1和bcl-2蛋白的表達而阻礙細胞周期進展、誘導前列腺癌細胞凋亡和抑制其生長增殖