基因工程乙肝表面抗原的表達(dá)、純化及應(yīng)用.pdf

1、乙型肝炎(HepatitisB，HB)是由乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)引起的世界范圍的傳染性疾病，其囊膜蛋白乙肝表面抗原(HepatitisBsurfaceantigen，HBsAg)能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體乙肝表面抗體(HepatitisBsurfaceantibody,HBsAb)，是乙肝疫苗的主要成分。同時(shí)，HBsAg也是ELISA診斷免疫是否成功的主要試劑成分。大量制備HBsAg在預(yù)防和檢測(cè)方面有重要

2、意義。本實(shí)驗(yàn)開展了HBsAg的體外表達(dá)及表達(dá)后初步純化、應(yīng)用的研究工作。 從已確診的乙肝病人血清中提取DNA，利用Primer5.0，參照GeneBank發(fā)表的序列，設(shè)計(jì)針對(duì)編碼HBsAgS基因的特異性引物。PCR擴(kuò)增S基因，將其分別克隆入畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)載體pPICZB和分泌型表達(dá)載體pPICZaA中，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPICZS和pPICZaS。構(gòu)建的重組子經(jīng)SacI線性化后，電轉(zhuǎn)化入酵母菌株GS115。利用抗生素Zeoc

3、in篩選重組子，誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行Western-blot，ELISA鑒定。結(jié)果表明，HBsAg在畢赤酵母中得到胞內(nèi)表達(dá)，未得到分泌表達(dá)。經(jīng)增加抗生素Zeocin的濃度篩選出高表達(dá)的工程菌GS115-pPICZS。擴(kuò)大培養(yǎng)后，進(jìn)一步研究表明，96h為最佳收獲時(shí)間，表達(dá)量達(dá)0.31g/L(40g菌體沉淀濕重)。經(jīng)鎳柱親和層析純化，得到較純的HBsAg，其免疫原性與反應(yīng)原性良好，能夠成為工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)良菌株。 同時(shí)，為了提高HBsAg