豬附紅細(xì)胞體PCR檢測(cè)及體外培養(yǎng)方法的建立.pdf

1、附紅細(xì)胞體病(Eperythrozoonosis)是廣泛存在于人和動(dòng)物體內(nèi)的一種人畜共患病，己對(duì)養(yǎng)殖業(yè)和人類健康造成巨大威脅。豬附紅細(xì)胞體病是由豬附紅細(xì)胞體附著在紅細(xì)胞上或者寄生于血漿中而引起。主要表現(xiàn)為急性型高熱、黃疸、貧血等癥狀；慢性感染引起動(dòng)物生長(zhǎng)緩慢和母豬的繁殖障礙。所以對(duì)該病的研究就顯得十分重要。本研究對(duì)豬附紅細(xì)胞體的病原形態(tài)、生物學(xué)特性以及體外培養(yǎng)方法進(jìn)行了初步的探索，并建立了特異性強(qiáng)、敏感性高的PCR快速診斷方法。

2、　　 目前，學(xué)者對(duì)豬附紅細(xì)胞體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性尚有很多爭(zhēng)議。為確定病原，本試驗(yàn)采用鮮血壓片鏡檢，血液涂片染色鏡檢和掃描電鏡觀察等方法對(duì)該病原進(jìn)行研究。觀察到的豬附紅細(xì)胞體以圓形和短桿狀為主；吉姆薩染色呈藍(lán)紫色，有折光性；掃描電鏡顯示寄生在紅細(xì)胞變形后的毛刺頂端，推測(cè)其可能是以出芽方式繁殖。這與其他學(xué)者的報(bào)道基本一致。
　　 根據(jù)GenBank上已報(bào)道的豬附紅細(xì)胞體16S rRNA的序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并

3、將產(chǎn)物克隆到T—vector后測(cè)序。結(jié)果表明擴(kuò)增到的目的基因片段為404 bp，與GenBank上坳coplasma suis序列同源性為97％。試驗(yàn)建立的PCR診斷方法特異性強(qiáng)，與健康豬血液、豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、弓形蟲(chóng)、豬圓環(huán)病毒DNA無(wú)交叉反應(yīng)，能檢測(cè)出的最低DNA濃度是8.6fg/μl。PCR診斷方法的敏感性、特異性和診斷率均為100％，明顯優(yōu)于血液涂片染色鏡檢方法。應(yīng)用該方法對(duì)浙江部分地區(qū)豬

4、附紅細(xì)胞體病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查顯示：檢測(cè)樣品80份，其中陽(yáng)性8份，感染率為10％。該方法具有快速、準(zhǔn)確、敏感等特點(diǎn)，適合于豬附紅細(xì)胞體病的早期診斷，同時(shí)也為豬附紅細(xì)胞體病分子流行病學(xué)的調(diào)查提供技術(shù)支撐。
　　 為建立簡(jiǎn)單穩(wěn)定、成本低的豬附紅細(xì)胞體體外培養(yǎng)方法，本試驗(yàn)在前人報(bào)道的方法基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。取96孔培養(yǎng)板每孔加入170μl完全培養(yǎng)液，25μl經(jīng)PBS洗滌后備用的正常豬紅細(xì)胞泥和5μl感染附紅細(xì)胞體的紅細(xì)胞泥，使每孔的總體積保