RNAi抑制bcr-abl融合基因表達(dá)及其對K562細(xì)胞的影響.pdf

1、慢性粒細(xì)胞白血病(CML)是起源于多能造血干細(xì)胞的惡性克隆增殖性疾病。95％的CML具有曲染色體，該染色體是由于9，22號染色體易位導(dǎo)致的t(9；22)(q34；q11)。22號染色體bcr基因的N端與9號染色體abl基因的C端(外顯子2-11)聯(lián)結(jié)在一起形成bcr/abl融合基因，編碼210KD的癌蛋白。與內(nèi)源性的abl(p120)相比，ber/abl(p210)具有持續(xù)的酪氨酸激酶活性。體外細(xì)胞株及動物實驗結(jié)果表明，p210對于CM

2、L的發(fā)病是必需的。P210使細(xì)胞增殖增加，凋亡受阻和粘附缺陷。因此，bcr/abl融合蛋白在揭示CML的分子病理機制及治療中有重要意義，并為臨床治療提供了新的靶點。 新興的RNA干擾技術(shù)是一種由雙鏈RNA誘導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，它可以降解特定的mRNA，使之無法翻譯成蛋白質(zhì)，從而抑制特定基因的表達(dá)。Elbashir等證實在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)RNAi作用的實際上是一些21．23個核苷酸的短小雙鏈RNA(smallinterferingRNAs

3、，siRNAs)，并且在體外轉(zhuǎn)入哺乳動物細(xì)胞后，同樣可以使特定基因的表達(dá)受到有效抑制。該方法是一種高效的、特異的研究基因功能的技術(shù)，并有可能成為一種有效的基因治療手段。本研究應(yīng)用特異的針對bcr／ablmRNA的siRNA，在mRNA水平阻斷bcr/abl的表達(dá)，觀察阻斷融合基因表達(dá)后腫瘤細(xì)胞生長和增殖的改變，并研究對融合基因部分相關(guān)下游轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的影響，進一步探討ber/abl融合基因在慢性粒細(xì)胞白血病形成中的作用和可能的分子機制，為臨

4、床提供一種可能的靶向治療手段。本研究分為以下四個部分： 第一部分實時定量RT-PCR檢測bcr／abl融合基因的方法建立及臨床應(yīng)用穩(wěn)定建立了以TaqManTM技術(shù)原理為基礎(chǔ)的實時定量RT-PCR技術(shù)檢測慢性粒細(xì)胞白血病ber／ablmRNA的方法，探討CMLbcr／abl融合基因的表達(dá)水平與臨床療效的關(guān)系。該方法可同時檢測b2a2和b3a2兩種亞型，GAPDH的mRNA作為內(nèi)參照，檢測了14例CML患者22個樣本的融合基因表達(dá)水

5、平，并動態(tài)觀察了2例異基因造血干細(xì)胞移植(Allo-HematopoieticStemCelTransplantation，AIIo-HSCT)復(fù)發(fā)后ber／ablmRNA表達(dá)量與臨床療效的關(guān)系。國內(nèi)尚未見類似報道。Bcffabl及GAPDH標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均為0．999；靈敏度為10-6；14例初診患者的mRNA表達(dá)水平范圍為2．8l～145；2例異基因造血干細(xì)胞移植后復(fù)發(fā)患者的ber／ablmRNA表達(dá)水平的改變與臨床疾病進展關(guān)系

6、相一致；CML患者骨髓和外周血bcr／abl表達(dá)水平一致。實時定量RT-PCR檢測CML患者的ber／abl融合基因敏感可靠、重復(fù)性好，有助于反映白血病細(xì)胞負(fù)荷、評價療效、判斷疾病預(yù)后及指導(dǎo)臨床治療。 第二部分siRNA對bcr/abl融合基因表達(dá)的特異性阻斷 RNA干擾技術(shù)是一種由雙鏈RNA誘導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，它可以降解特定的mRNA，使之無法翻譯成蛋白質(zhì)，從而抑制特定基因的表達(dá)。Heidenreich己采用RNAi技

7、術(shù)成功抑制了具有t(8；21)易位的AMLl/MTG8融合基因的表達(dá)，mRNA抑制率達(dá)50％～80％，AMLl/MTG8融合蛋白也有相應(yīng)的下降。目前國內(nèi)多通過siRNA表達(dá)載體、PCR制備的siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生siRNA等進行RNAi研究?；瘜W(xué)合成法雖成本昂貴，但特異性好，抑制效率高。我們首先嘗試采用體外化學(xué)合成的siRNA進行抑制血液系統(tǒng)惡性腫瘤特定基因表達(dá)的相關(guān)研究，國內(nèi)尚未見報道。針對CMLbcr/abl融合基因位點體

8、外化學(xué)合成siRNA-S序列，轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)ber/abl融合蛋白的K562細(xì)胞。比較電穿孔與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的方法的可行性及轉(zhuǎn)染效率，在體外化學(xué)合成的雙鏈siRNA分子5'端標(biāo)記熒光分子用以確定轉(zhuǎn)染效率，屬國內(nèi)領(lǐng)先。應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR、Westernblots檢測siRNA片段對bcr/ablmRNA和蛋白表達(dá)的抑制作用。以具有三個位點突變的siRNA序列(siRNAmut)為對照檢測RNAi作用的特異性。我們觀察到：電

9、穿孔可有效轉(zhuǎn)染siRNA至K562細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率在70％以上，高于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(50％～60％)。FAM標(biāo)記的siRNA不適合應(yīng)用于電穿孔轉(zhuǎn)染效率的監(jiān)測。SiRNA-S可抑制K562細(xì)胞bcr/abl融合基因的表達(dá)，雖然轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)的siRNA會隨轉(zhuǎn)染濃度的增加而增加，但抑制作用不會隨之增加。SiRNA-S的最佳作用劑量為200nM，作用效果短暫，最佳作用時間為48小時。實時熒光定量RT-PCR和Westernbios檢測結(jié)果顯示，si

10、RNA-S可導(dǎo)致ber/ablmRNA下降約67％(轉(zhuǎn)染24小時)和72％(轉(zhuǎn)染48小時)，同時伴隨有ber/abl蛋白表達(dá)下降，但對ablmRNA和蛋白的表達(dá)無影響。轉(zhuǎn)染siRNAmut對I(562細(xì)胞中ber/ablmRNA和蛋白表達(dá)均無明顯影響，說明siRNA-S具有高度的序列專一性和有效的干擾活力。國外只有Schen及Wilda等人進行了此方面的相關(guān)研究，我們的實驗結(jié)果與之基本一致。實驗證明，siRNA可特異、有效地抑制bcr/

11、abl融合基因的表達(dá)，為研究ber/abl基因功能及其下游信號提供了有效方法；亦為臨床自體造血干細(xì)胞移植前造血干細(xì)胞的體外凈化提供了頗具前景的方法：siRNA穩(wěn)定、不需要化學(xué)修飾、用量低且抑制率高，有可能解決傳統(tǒng)反義核酸技術(shù)基因治療的難題。 第三部分RNAi對1(,562腫瘤細(xì)胞生長和增殖的影響 Ber/abl融合蛋白在體外可導(dǎo)致多種細(xì)胞系的轉(zhuǎn)化，對維持腫瘤細(xì)胞的生長、增殖也有重要的作用。SiRNA阻斷bcr/abl融合

12、基因表達(dá)后，K562細(xì)胞生物學(xué)特性可能會發(fā)生相應(yīng)改變。應(yīng)用臺盼藍(lán)拒染法和MTT法檢測siRNA對腫瘤細(xì)胞增殖的影響，應(yīng)用AnnexinVoFITC，DNALadder等方法檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡。轉(zhuǎn)染含點突變的siRNAmut序列為對照檢測其對腫瘤細(xì)胞的影響，以空白轉(zhuǎn)染組作對照檢測轉(zhuǎn)染方式的非特異細(xì)胞毒性作用。實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染siRNA-S的細(xì)胞經(jīng)臺盼藍(lán)拒染和MTT檢測后，顯示其可短暫抑制K562細(xì)胞的增殖；出現(xiàn)典型的DNALadder改變；

13、AnnexinV-FITC染色顯示，K562細(xì)胞在轉(zhuǎn)染siRNA-S后死亡與凋亡的比例共為42.10％(24小時)和53.33％(48小時)，其中凋亡比例只占有15.05％(24小時)和19.47％(48小時)。RNAi后，K562細(xì)胞死亡比例隨凋亡比例升高而明顯升高，分別為27.05％(24小時)和33.86％(48小時)，而對照組和siRNA-Smut組分別僅為0.63％和4.55％。提示siRNA-S可抑制腫瘤細(xì)胞生長；不僅誘導(dǎo)腫

14、瘤細(xì)胞的凋亡，還導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。SiRNAmut則無明顯的抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及死亡的作用。說明siRNA-S對K562細(xì)胞增殖的抑制作用特異且有效。Wohlbold等人發(fā)現(xiàn)K562細(xì)胞在轉(zhuǎn)染dsRNA48小時后的細(xì)胞生物學(xué)的變化是凋亡率增高。我們不但觀察到SiRNA-S轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后凋亡的增加，而且觀察到K562細(xì)胞的死亡也明顯增加。進一步證實bcr／abl融合基因的表達(dá)對維持CML腫瘤細(xì)胞的分裂和增殖具有重要作用。

15、 第四部分RNAi對bcr/abl相關(guān)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的影響 具有酪氨酸激酶活性的bcr/abl融合蛋白已被證實與細(xì)胞的增殖分化相關(guān)。但腫瘤的發(fā)生發(fā)展的分子機制是相當(dāng)復(fù)雜的，可能涉及了許多細(xì)胞信號分子。目前發(fā)現(xiàn)的可能與bcr/abl相關(guān)的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)有RAS途徑和JAK/STAT途徑等，siRNA干擾后會通過哪些分子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響細(xì)胞的生物學(xué)活性尚不清楚，也未見到相關(guān)文獻報道。JAK／STAT信號途徑在大多數(shù)表達(dá)bc

16、r/abl的細(xì)胞系中被活化[51,52]，而JAK2和STAT5在CML的發(fā)病機制中起重要作用。故本研究應(yīng)用Westernblots檢測RNAi干擾前后的JAK2與STAT5表達(dá)水平的變化。實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA-S的K562細(xì)胞較未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，JAK2及STAT5蛋白表達(dá)水平明顯降低。轉(zhuǎn)染點突變的siRNAmut序列與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞比較，JAK2與STAT5蛋白表達(dá)水平均無明顯改變。證明siRNA-S抑制bcr/abl融合基因

17、表達(dá)后，進一步抑制JAK2/STAT5通路的激活，從而降低腫瘤細(xì)胞的抗凋亡作用，進而可能產(chǎn)生其它生物學(xué)效應(yīng)。進一步證實，JAK/STAT是bcr/abl重要的下游信號分子，為CML的基因治療提供了新的潛在治療靶點。 綜上所述，本研究首先建立了可臨床應(yīng)用的敏感可靠的實時定量RT-PCR檢測bcr/abl融合基因的技術(shù)。應(yīng)用針對bcr/abl融合蛋白特異、有效的siRNA抑制bcr/abl融合基因的表達(dá)。從而抑制了K562腫瘤細(xì)胞的