同種異體脫細胞基質構建組織工程化氣管的實驗研究.pdf

1、目的：外傷、腫瘤及先天性疾病造成的氣管缺損在臨床上較為常見。在缺損較短時，可直接行端端吻合修復，而一旦環(huán)狀缺損超過5個環(huán)或3cm，端端吻合就明顯較為困難。此時，尋找氣管替代物進行氣管重建是最為理想的治療手段。自19世紀末氣管外科發(fā)展以來，氣管重建替代物的研究主要集中在人工氣管、自體組織、同種異體氣管及組織工程化氣管上，其中組織工程化氣管因其在免疫排斥、材料來源等方面的優(yōu)勢逐漸成為氣管重建外科的研究熱點。組織工程化氣管即為將經體外擴增的種

2、子細胞接種在具有環(huán)樣結構的支架材料上，通過細胞之間相互黏附、生長繁殖、分泌細胞外基質，形成一定形狀且具有一定功能的氣管環(huán)，原位移植從而達到修復缺損、重建功能的目的。本研究的目的是使用化學消化法脫除同種異體氣管環(huán)組織內細胞成分，形成氣管組織脫細胞基質。同時采用自體骨髓MSCs體外誘導向軟骨細胞分化作為種子細胞，與同種異體氣管脫細胞基質共同培養(yǎng)，觀察誘導的MSCs在脫細胞基質上的黏附、生長和增殖情況，以期尋找到組織工程化氣管構建理想的種子細

3、胞和生物支架材料。 方法： 1、取4月齡Beagle犬6只，行雙側脛骨結節(jié)平臺穿刺抽取骨髓14～16ml，以1.073g/ml密度Percoll分離液結合貼壁法分離純化骨髓間充質干細胞(Mesetlchymal stem cells，MSCs)，體外培養(yǎng)傳代。取第3代細胞在含15﹪FBS的L-DMEM培養(yǎng)基內加入TGF-β1濃度為10ng/ml、IGF-I為10ng/ml，維生素C為37.5 μ g/ml，轉鐵蛋白6.2

4、5μg/ml進行成軟骨細胞定向誘導，對照組未添加任何細胞因子。通過相差顯微鏡每日觀察細胞生長和形態(tài)變化情況；MTT法監(jiān)測細胞生長情況變化并繪制生長曲線；阿爾新蘭法檢測細胞培養(yǎng)液內GAG含量變化；細胞單層爬片作甲苯胺藍、Masson三色染色和Ⅱ型膠原免疫組化等組織學方法觀察誘導細胞軟骨細胞基質分泌和Ⅱ型膠原生成情況。觀察骨髓問充質干細胞向軟骨細胞分化的情況。 2、另取4～6月齡當地健康雜種犬，處死后立即手術切取甲狀軟骨下第6～10環(huán)氣管段

5、，以無菌PBS沖洗后，順序浸入1﹪Triton X-100和DNAse、RNAse溶液內振蕩消化。其中以1﹪Trixton消化時間長短分為24小時組、48小時組、72小時組和120小時組。分別采用組織切片HE染色、掃描電鏡等方法觀察樣本脫細胞效果并比較。 3、收集誘導第7天骨髓MSCs，調整細胞濃度為3×10<'6>/ml，與經處理的同種異體氣管脫細胞基質體外復合培養(yǎng)，于第3、7、14天取復合物行電鏡觀察MSCs在脫細胞基質表面

6、黏附生長情況。取體外培養(yǎng)第7天復合物與單純脫細胞基質及新鮮同種異體氣管環(huán)樣本分別埋植宿主犬皮下，分別于第14天和第30天取出埋植物行組織切片MSCs在脫細胞基質內的生長情況，觀察軟骨基質內有無細胞成分生成。 結果： 1、倒置相差顯微鏡下觀察初接種時原代MSCs24小時開始逐漸貼壁，72小時貼壁細胞明顯增多，5天左右形成分布均勻的細胞集落，7～8天集落逐漸增大，相鄰集落融合成片狀。10天左右原代細胞鋪展面積可達到80﹪以上

7、。傳代細胞融合速度明顯加快，細胞變大，MTT生長曲線顯示P1代次細胞生長能力最為旺盛，至P3代細胞生長情況逐漸穩(wěn)定。 2、加入誘導因子后細胞逐漸變圓變大，增殖速度加快。MTT檢測顯示P3細胞誘導組生長曲線較未誘導組明顯左移。誘導14天細胞培養(yǎng)液內gAG含量(42.48±2.32)μg/ml較同代次未誘導組(19.62±1.30)μg/ml升高(p<0.01)。誘導第14天細胞甲苯胺藍染色見胞漿內廣泛藍染，Masson三色染色見胞

8、漿綠染，Ⅱ型膠原免疫組化染色見胞漿內黃色或棕黃色顆粒出現，而未誘導組陽性細胞不明顯。 3、使用1﹪Triton X-100溶液與酶聯合消化法制備犬同種異體氣管脫細胞基質至少需要作用120小時，方可完全脫除氣管黏膜及軟骨部分全部細胞成分。HE染色顯示120小時組氣管樣本細胞成分完全脫失，黏膜脫細胞基質局部與軟骨基質分離，軟骨基質完整無明顯破壞；掃描電鏡顯示氣管脫細胞基質黏膜細胞及軟骨細胞脫除徹底，去除黏膜部分可見軟骨基質表面軟骨陷

9、窩結構清晰，陷窩內無細胞結構。 4、誘導MSCs與異體氣管脫細胞基質體外聯合培養(yǎng)3天電鏡下即可見細胞定植于基質表面，有偽足伸出。7天時可見數層細胞生長于基質表面，細胞之間互相連接成片狀，并有大量細胞外基質分泌，呈“冰霜”樣改變。14天時可見基質表面細胞出現凋亡，部分細胞呈空泡樣改變。復合物宿主犬皮下埋植14天HE染色基質表面可見多層細胞，細胞呈扁長形，胞核較大。軟骨脫細胞基質內部未見細胞長入。周圍有肉芽組織包裹，可見少量淋巴細胞

10、浸潤。30天時軟骨基質淺層可見少量細胞成分長入，但無明顯新生軟骨形成。大部分軟骨膠原基質被破壞分解，可見較多淋巴細胞浸潤。 結論： 1、骨髓間充質干細胞是軟骨組織工程理想的種子細胞。取材方便，Percoll分離液分離結合貼壁純化可以獲取大量骨髓問充質干細胞，體外培養(yǎng)性能穩(wěn)定，易于傳代擴增，在一定誘導條件的培養(yǎng)下，可以分化為軟骨細胞。 2、去污劑-核酸酶聯合消化法使用1﹪Triton X-100可有效去除氣管樣本全