硫化氫緩解缺血再灌注腎損傷機制研究.pdf

1、急性腎衰竭(acute renal failure，ARF)是由各種病因引起，腎功能在短期內(數(shù)小時至數(shù)天)迅速減退，腎小球濾過功能顯著下降，血尿素氮及肌酐迅速升高，并引起機體水、電解質和酸堿平衡失調，以及急性尿毒癥等的臨床綜合癥狀。腎缺血再灌注導致的腎臟損傷(renal ischemia reperfusion injury，RIRI)是導致缺血性ARF的主要原因，在器官移植中更是難以避免。RIRI發(fā)生機制復雜，涉及自由基的作用、細胞

2、鈣超載、能量代謝障礙等，有資料顯示炎性介質、粘附分子、多種細胞因子參與RIRI，但至今其發(fā)病機制尚未完全闡明。
　　急性腎衰竭中腎臟損傷若不能及時修復，可導致病變持續(xù)數(shù)周甚至多年，轉變成不可逆的慢性進行性腎功能不全。2010年12月，Kidney International雜志連續(xù)刊登5篇review，均把腎移植后腎功能變化的關注焦點集中在遠期效應上，從對腎移植后的遠期保護性干預、感染與慢性移植腎損傷、病理學改變等方面探討了慢性移

3、植損傷。關于腎缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)的研究，局限于24 hr以內的急性期和單一的觀察時間點明顯不夠，因此，在本課題中選擇了缺血再灌注6 hr、24 hr、3d、7d和21d作為觀察時間點，以充分反應急性期和亞急性期的腎損傷情況。
　　硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是繼一氧化碳和一氧化氮之后的又一內源性氣體信號分子，近年來H2S在體內的生物學效應受到廣泛關注。最新研究表明其

4、在機體內參與多種生物學功能調節(jié)，內源性H2S代謝異常與多種系統(tǒng)疾病，包括循環(huán)、消化、神經(jīng)、呼吸等系統(tǒng)疾病發(fā)生關系密切。
　　內源性H2S主要有兩大來源：酶合成途徑和非酶途徑。酶合成途徑是體內H2S的主要來源，通過體內的半胱氨酸5-磷酸毗哆醛依賴性的酶-胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-cynthase，CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)催化產(chǎn)生H2S。CBS和CSE

5、的表達具有組織特異性，腎臟中同時存在CBS和CSE表達，且H2S合成水平較高。然而關于內源性H2S在腎臟生理與病理生理過程中的作用至今報道很少，且主要圍繞高血壓腎病和糖尿病腎病。
　　本課題組前期報道了H2S對糖尿病腎病具有保護作用，明確糖尿病早期CSE表達減少，與高糖引起的腎臟組織氧化應激發(fā)生有關。在離體培養(yǎng)的腎小球系膜細胞中，外源性給予NaHS(H2S供體)可抑制高糖引起的活性氧增多。活性氧生成增加是缺血再灌注致器官損傷的共同

6、特征和重要機制。關于H2S在I/R中的作用，已有的文獻報道，在心血管系統(tǒng)中，特別是心肌缺血再灌注中，H2S能緩解心肌損害，然而，在腎臟缺血再灌注過程中，內源性H2S生成有何變化，H2S能否通過緩解腎臟I/R氧化應激的發(fā)生而發(fā)揮保護作用，如果H2S能有保護作用，其在體內的作用途徑和具體機制是什么等都是我們在本課題中關心的問題。
　　腎小球系膜細胞(mesangial cells，MCs)是腎小球內一種固有的血管外周細胞，具有舒縮功能

7、，參與腎小球血流量的調節(jié)。目前已有大量實驗研究證實，MCs的異常增殖、細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的合成和分泌異常升高是腎小球硬化最重要的原因。以往對I/R的損傷研究集中于腎小管細胞，但在我們的實驗中明確觀察到，I/R可引起腎臟炎癥因子和纖維化相關細胞因子的表達成倍上調，且腎皮質的變化早于髓質，提示腎小球固有細胞可能在其中發(fā)揮作用。2010年Kim的報道也提示，在RIRI的發(fā)生機制中，腎臟的不同細胞可以

8、表現(xiàn)出不同的應答模式。然而，關于MCs是否參與RIRI，特別是急性期過后的腎損傷則沒有明確答案。因此，本課題中，我們結合整體動物模型的觀察結果，選擇腎小球系膜細胞作為離體研究的對象，采用缺氧-復氧模型開展研究。
　　內質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是指內質網(wǎng)受到諸如缺血、缺氧、鈣超載、ATP耗竭等應激刺激，導致內質網(wǎng)內未折疊蛋白、錯誤折疊蛋白堆積等引發(fā)內質網(wǎng)乃至細胞功能紊亂的狀態(tài)。ER

9、S是細胞的一種自我保護性機制，適度的ERS可通過激活未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)來保護由ERS所引起的細胞損傷，恢復細胞功能。但過強或時間過長的ERS則將誘導一系列細胞因子的大量釋放，甚至啟動細胞凋亡機制最終導致細胞凋亡。
　　腎缺血和再灌注可引起細胞內質網(wǎng)應激發(fā)生，后者又與腎缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關。一方面有研究表明，缺血再灌注可啟動強烈的內質網(wǎng)應激反應，并激活細胞

10、凋亡途徑；但同時，翼志勇等報道，通過預處理誘導內質網(wǎng)應激發(fā)生可有效減少I/R引起的腎損傷。ERS作為一把雙刃劍，是參與I/R的損傷機制還是在其中發(fā)揮保護作用，硫化氫對ERS又有何作用等也是本課題所關心的問題。
　　由此，本論文由三部分組成：
　　一、缺血再灌注損傷過程中內源性H2S生成改變及給予外源性H2S對缺血再灌注腎損傷的緩解作用
　　1.本課題研究采用夾閉大鼠腎動脈造成腎雙側缺血，60 min后恢復血供進行再灌注

11、的腎臟缺血再灌注動物模型。首先于缺血再灌注后6 hr觀察到腎皮質H2S濃度低于假手術組，但腎髓質尚無變化。外源性給予NaHS(100μg/kg)對假手術大鼠血肌酐、尿素氮無影響，也不引起正常大鼠腎臟的形態(tài)學改變。
　　2.實驗共收集5個時間點的動物樣本，分別為再灌注后6 hr、24 hr、3d、7d和21d，收集樣本包括24小時尿液、血清和腎臟組織。腎功能和尿蛋白結果顯示，腎缺血再灌注后6 hr，I/R組血肌酐、尿素氮已顯著升高，

12、隨時程延長，雖有緩解，但血肌酐、尿素氮數(shù)值始終高于假手術組。HE染色同樣提示腎臟存在病理改變。
　　3.腎組織缺血后50 min，即再灌注前10 min，腹腔注射NaHS，作為I/R+NaHS組。對該組大鼠腎功能、尿蛋白和病理形態(tài)學觀察的結果顯示，腎缺血再灌注后的急性期內，即6 hr和24 hr的腎臟功能和形態(tài)學改變與I/R組一致，但7d和21 d時都顯著優(yōu)于I/R組，提示再灌注前外源性給予H2S可以改善缺血再灌注腎臟亞急性期的損

13、傷效應。
　　4.炎癥因子的異常啟動，腎臟組織出現(xiàn)非特異性炎癥反應是造成再灌注損傷的重要因素，其中白介素6(interleukin6，IL-6)是參與腎臟非特異性炎癥反應的重要炎癥因子之一。本實驗中檢測了大鼠血清IL-6水平，觀察到缺血再灌注6 hr后，I/R與I/R+NaHS組血清IL-6水平均有顯著上升，較假手術組高出近3倍，此后，IL-6水平下降，但I/R組仍持續(xù)高于假手術組，而I/R+NaHS組則從24 hr起即與假手術組

14、無差別。腎臟皮質IL-6 mRNA水平I/R組在5個觀察時間點都顯著升高，峰值出現(xiàn)在24 hr，約為假手術組的8倍。I/R+NaHS組腎皮質IL-6表達水平也顯著升高，但低于I/R組。腎臟髓質IL-6表達水平I/R組與I/R+NaHS組在缺血再灌注后6 hr都無明顯變化。I/R組從24 hr點起，表達水平顯著升高，3d時達高峰，可達假手術組的6倍。I/R+NaHS組自3d起，也觀察到IL-6 mRNA表達上調，但低于I/R組。上述結果提

15、示，腎組織IL-6水平在腎缺血再灌注后出現(xiàn)明顯的升高，且主要來源并非血液循環(huán)。腎皮質的表達水平升高早于髓質。給予外源性H2S能部分抑制IL-6生成的增多，減輕非特異性炎癥反應。
　　單核細胞趨化因子(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是趨化因子家族的重要成員，在腎損害中起著重要作用。本實驗中也觀察了腎皮質MCP-1的表達水平，其在I/R組和I/R+NaHS組表現(xiàn)出了與IL-6同樣的變

16、化趨勢，進一步確認了I/R可引起組織局部非特異性炎癥反應的發(fā)生，及H2S能抑制該反應的效應。
　　5.腎臟纖維化是導致腎功能減退的重要病理改變之一。轉化生長因子(transforming growth factor-β，TGF-β)是促進纖維化的重要細胞因子。本實驗中檢測了腎皮質TGF-β的mRNA水平，觀察到24 hr I/R與I/R+NaHS組TGF-β表達水平并未出現(xiàn)明顯變化。但3d起，表達水平顯著升高，I/R組TGF-β

17、mRNA水平約為假手術組的8倍，I/R+NaHS組則顯著低于I/R組。纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)是TGF-β重要的下游效應分子，也是腎組織重要的細胞外基質成分，與TGF-β共同參與了腎纖維化的進程。本實驗中觀察到腎皮質FN mRNA水平在I/R組和I/R+NaHS組表現(xiàn)出與TGF-β相一致的變化趨勢，提示腎臟在缺血再灌注急性期過去后，可出現(xiàn)纖維化相關基因的表達上調，這可能是遠期腎臟發(fā)生纖維化并引起腎功能減退的重要原因。

18、而外源性給予H2S能顯著抑制上述基因的表達上調，提示H2S將可能有助于緩解腎纖維化的發(fā)生與發(fā)展以及繼發(fā)的慢性腎功能損傷。
　　二、H2S抑制I/R引起的組織活性氧生成及缺氧-復氧引起的系膜細胞功能變化
　　1.腎缺血再灌注后6 hr、24 hr、3d、7d和21d分別收集腎臟組織，勻漿后以lucigenin為探針，用化學發(fā)光技術定量測定組織活性氧水平。結果顯示，腎缺血再灌注引起腎組織內活性氧(reactive oxygen

19、species，ROS)水平升高，外源性給予硫化氫可抑制ROS生成的增多。
　　2.課題研究選擇離體培養(yǎng)腎臟系膜細胞作為細胞水平研究的對象，將細胞置于缺氧試劑盒中培養(yǎng)2h，然后恢復常氧繼續(xù)培養(yǎng)，建立缺氧-復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)細胞模型，模擬機體缺氧/再灌注損傷模型。利用DCFH-DA熒光探針進行細胞水平活性氧檢測，觀察到缺氧2h后復氧時，細胞ROS水平顯著升高，隨后下降，在復氧2h恢復至對照水平

20、，繼而再次升高，在6h達峰值，并于12 h再次恢復至對照水平。采用缺氧前和復氧初兩次給予NaHS(30μM)，可抑制H/R引起的ROS生成增多。僅缺氧前給予NaHS預處理，雖然對復氧初的ROS增多有一定抑制作用，但對后繼出現(xiàn)的第二次ROS水平升高無顯著影響。若僅在復氧后給予NaHS，則可明顯抑制第二次ROS生成高峰，提示H/R引起的ROS增多可出現(xiàn)兩次高峰，其中缺氧可能與第一次高峰的出現(xiàn)有關，而復氧引起ROS第二次高峰。因此，復氧后給予

21、NaHS處理可抑制ROS生成的第二個高峰。
　　3.H/R引起系膜細胞IL-6 mRNA表達增加，培液IL-6水平升高，在復氧初給予NaHS，可顯著抑制上述效應，提示在細胞水平，H2S也抑制了非特異性炎癥反應。另外，NaHS還可抑制H/R引起的系膜細胞增殖效應。由于腎小球硬化，腎臟纖維化等病理變化中，系膜細胞過度增殖及分泌的細胞因子都起了重要作用，因此，NaHS抑制H/R引起的IL-6水平升高和系膜細胞的增殖作用，在整體上可能是其

22、改善腎缺血再灌注后腎損傷的細胞機制之一。
　　4.實驗中給予NADPH氧化酶抑制劑二亞苯基碘(diphenylenechloride iodonium，DPI)后，可完全抑制H/R引起的ROS增多，提示H/R引起的ROS生成增加主要來自NADPH氧化酶代謝途徑。給予DPI處理也抑制了H/R引起的IL-6 mRNA表達上調和系膜細胞增殖效應，提示IL-6的生成和細胞的增殖是由ROS生成增加所致。
　　三、腎缺血再灌注激活內質網(wǎng)

23、應激
　　1.腎缺血再灌注后，腎組織可觀察到內質網(wǎng)應激的標志性蛋白葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose regulating protein78，GRP78)水平顯著升高。在細胞水平，缺氧-復氧引起系膜細胞GRP78蛋白水平和真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor2α，eIF2α)磷酸化水平升高，提示腎臟缺血再灌注或細胞缺氧，復氧可引起內質網(wǎng)應激反應發(fā)生。
　　2.給予外源性H2S抑制了24

24、 hr時間點觀察到的缺血再灌注引起的組織內質網(wǎng)應激及缺氧-復氧后12 hr時間點時所觀察到的系膜細胞內質網(wǎng)應激反應。在離體培養(yǎng)的系膜細胞中，單純給予NaHS不影響正常細胞內質網(wǎng)應激水平。
　　3.在系膜細胞上給予ERS誘導劑毒胡蘿卜素(thapsigargin，TG)或衣霉素(tunicamycin，TM)誘發(fā)內質網(wǎng)應激，用NaHS預處理對TG或TM引起的GRP78蛋白水平和eIF2α磷酸化水平無影響，提示硫化氫本身對內質網(wǎng)應激可

25、能無明顯直接抑制效應，其抑制腎缺血再灌注或缺氧.復氧引起的內質網(wǎng)應激可能與其抑制內質網(wǎng)應激上游刺激因子，如ROS、炎癥因子等的生成有關。
　　綜上所述，本研究詳細觀察了腎缺血再灌注后早期腎臟功能、形態(tài)學、組織局部ROS、炎癥因子和纖維化相關細胞因子水平的變化過程，為尋找和闡明腎功能障礙的早期發(fā)生機制提供了有意義的實驗依據(jù)。課題中觀察到硫化氫可抑制缺血再灌注腎組織的活性氧升高，減少組織局部的炎癥因子和纖維化相關細胞因子的表達，這對于