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文檔簡介
1、目的: 采用大鼠原代肝細(xì)胞體外溫孵液對蛇床子素(Ost)在肝細(xì)胞中代謝轉(zhuǎn)化過程進(jìn)行研究。分析Ost在大鼠肝細(xì)胞中的代謝途徑和機(jī)制,探討Ost在CYP450酶系相關(guān)亞型中的代謝,及CYP450酶誘導(dǎo)劑和抑制劑對Ost代謝的影響。為更深入地研究Ost的藥動學(xué)及其臨床上合理用藥提供理論和實驗依據(jù)。 方法: ①建立大鼠原代肝細(xì)胞的分離方法和大鼠肝細(xì)胞體外溫孵體系。通過臺盼藍(lán)排斥實驗、光學(xué)顯微鏡、透射電鏡檢查、HE染色對肝
2、細(xì)胞的產(chǎn)率,活力,細(xì)胞的形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)等指標(biāo)進(jìn)行測定。 ②通過MTT方法測定不同濃度Ost對大鼠原代肝細(xì)胞活力的影響。 ③建立Ost的HPLC-UV檢測方法。 ④通過溫孵時間、肝細(xì)胞含量、底物濃度三個方面來考察Ost在大鼠肝細(xì)胞體外溫孵液中的酶促動力學(xué)特征。 ⑤研究CYP3A4誘導(dǎo)劑利福平(Rif)、CYP2D6抑制劑育亨賓(Yoh)、CYP2C9抑制劑磺胺嘧啶(Sul)、CYP2C8抑制劑槲皮素(Que
3、)對Ost在大鼠肝細(xì)胞溫孵液中代謝的影響。 ⑥選擇CYP3A4特異性抑制劑醋竹桃霉素(Tro),觀察其對Ost體外代謝的抑制效應(yīng)。 結(jié)果: ①建立了成熟的大鼠原代肝細(xì)胞的分離方法和大鼠原代肝細(xì)胞溫孵體系,肝細(xì)胞產(chǎn)率為1-2 × 108/肝,肝細(xì)胞活力和純度均在90%以上。 ②Ost的濃度在0-20μM范圍內(nèi)對大鼠原代肝細(xì)胞活力與空白對照組相比,未見顯著影響,肝細(xì)胞活力>80%。 ③Ost的HPLC
4、檢測方法為流動相:甲醇:雙蒸水=80:20(V/V);流速:1.0ml/min;檢測波長:322nm;靈敏度:0.004 Aufs。 ④Ost在大鼠肝細(xì)胞體外溫孵液中呈現(xiàn)明顯的酶促動力學(xué)特征:當(dāng)Ost的濃度在0-10μM,Ost的代謝呈濃度依賴性,代謝消除量隨底物濃度增加呈線性增加;當(dāng)濃度超過10μM,Ost代謝出現(xiàn)飽和現(xiàn)象,代謝消除量不再隨著底物濃度的增加而增加。Ost在大鼠肝細(xì)胞體外溫孵液中經(jīng)37℃空氣浴振蕩器振蕩孵育15~
5、120min,呈時間依賴性線性消除。溫孵液中肝細(xì)胞的濃度在5 × 105~1×107/ml范圍內(nèi),Ost的代謝量隨肝細(xì)胞濃度增加而增加,呈線性消除。⑤CYP2D6抑制劑Yoh、CYP2C9抑制劑Sul、CYP2C8抑制劑Que對Ost的代謝消除率的影響與對照組相比無明顯區(qū)別(P>0.05),在與CYP3A4誘導(dǎo)劑Rif共孵育的肝細(xì)胞溫孵液中Ost的代謝消除率與對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)。 ⑥CYP3A4抑制劑Tro
6、呈劑量依賴性抑制Ost在大鼠肝細(xì)胞中的代謝。 結(jié)論: 本實驗建立的大鼠原代肝細(xì)胞分離方法和肝細(xì)胞體外溫孵液穩(wěn)定、可靠,能滿足本實驗藥物代謝的要求。Ost在大鼠肝細(xì)胞體外溫孵液代謝實驗研究提示Ost的代謝具有酶促動力學(xué)代謝特征。CYP2D6抑制劑Yoh、CYP2C9抑制劑Sul、CYP2C8抑制劑Que不抑制Ost在大鼠肝細(xì)胞體外溫孵液中的代謝。CYP3A4誘導(dǎo)劑Rif則明顯誘導(dǎo)Ost的代謝;CYP3A4抑制劑Tro呈劑量
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