水稻蠟質(zhì)合成代謝基因WSL3及WSL4的克隆和功能分析.pdf

1、陸地植物表面覆蓋著一層蠟質(zhì)層，蠟質(zhì)作為植物表面與環(huán)境之間的第一層屏障，具有重要的功能。蠟質(zhì)能防止植物水分的流失，能屏蔽過(guò)量的紫外線，能形成自潔式的表面抵御外來(lái)的灰塵，能作為物理屏障來(lái)抵擋害蟲(chóng)和病原菌的侵害，還能在器官邊界確定上起到重要的作用。水稻作為重要的模式作物，對(duì)水稻蠟質(zhì)控制基因進(jìn)行研究，進(jìn)而利用其改良水稻的抗逆能力，具有重要的意義。本文以兩個(gè)水稻葉片蠟質(zhì)減少突變體Wax crystal-sparse leaf3(wsl3)和Wax

2、 crystal-sparse leaf4(wsl4)為材料，在表型鑒定的基礎(chǔ)上，利用圖位克隆技術(shù)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行了分離，進(jìn)一步對(duì)其功能進(jìn)行了初步的研究，主要內(nèi)容如下：
　　1.蠟質(zhì)突變體wsl3和wsl4的表型分析
　　通過(guò)對(duì)日本晴組培突變體庫(kù)的篩選，獲得了水稻葉片蠟質(zhì)減少的突變體wsl3和 wsl4。兩個(gè)突變體均呈現(xiàn)葉片沾水的表型，且wsl4突變體比野生型株高略矮，分蘗數(shù)減少。透射電鏡(TEM)觀察發(fā)現(xiàn)wsl3和wsl4突

3、變體葉片表皮增厚。掃描電鏡(SEM)觀察發(fā)現(xiàn)突變體葉片表面蠟質(zhì)晶體顯著性降低。GC-MS測(cè)定發(fā)現(xiàn)盡管突變體葉片表面角質(zhì)含量與野生型相當(dāng)，但是，突變體葉片表面蠟質(zhì)各成分含量相對(duì)于野生型則顯著性下降。生理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，wsl3和wsl4突變體的細(xì)胞膜通透性都有一定程度的升高。
　　2.蠟質(zhì)代謝合成基因WSL3和WSL4的圖位克隆和功能驗(yàn)證
　　利用圖位克隆技術(shù)，我們將WSL3定位于4號(hào)染色體InDel標(biāo)記M-2396和M-2404

4、之間83 kb區(qū)間內(nèi)，對(duì)該區(qū)間的基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)LOC_Os04g40730第一個(gè)外顯子的736和737的兩個(gè)連續(xù)的堿基GC突變?yōu)門(mén)T，導(dǎo)致了所編碼的蛋白質(zhì)第207位的氨基酸由丙氨酸突變?yōu)楸奖彼帷SL4基因定位于3號(hào)染色體InDel標(biāo)記M-6283和M-6341的58 kb區(qū)間內(nèi)，對(duì)該區(qū)間基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)Loc_Os03g12030基因的1281位的堿基由G突變?yōu)锳，位于第二個(gè)外顯子上，導(dǎo)致了所編碼的蛋白質(zhì)第312位的氨基酸由纈氨酸突變?yōu)榧?/p>

5、硫氨酸。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明LOC_Os04g40730和Loc_Os03g12030分別編碼KCR和KCS類蛋白，都是蠟質(zhì)合成途徑的基因。進(jìn)一步的遺傳互補(bǔ)和RNAi干擾實(shí)驗(yàn)表明這兩個(gè)基因即為目標(biāo)基因。
　　3.WSL3和WSL4基因的時(shí)空表達(dá)分析及亞細(xì)胞定位
　　利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和GUS表達(dá)實(shí)驗(yàn)對(duì)WSL3和WSL4兩個(gè)基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，WSL3和WSL4在根、莖、葉、花等各個(gè)組織中均有表達(dá)，

6、屬于組成型表達(dá)基因。構(gòu)建WSL3和WSL4基因的亞細(xì)胞定位GFP載體，在煙草中瞬時(shí)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)它們都能與ER marker共定位，表明WSL3和 WSL4蛋白都定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。
　　4.WSL3蛋白具有脂肪酸延長(zhǎng)酶活性
　　在酵母ybr159wΔ突變體中異源表達(dá)水稻的WSL3基因，其生長(zhǎng)缺陷的表型能得到恢復(fù)。當(dāng)WSL3基因與擬南芥的FAE1基因在ybr159wΔ突變體中共表達(dá)的時(shí)候，能在酵母ybr159wΔ突變體檢測(cè)到20:0