端?？s短影響原發(fā)性高血壓及其并發(fā)癥的發(fā)生.pdf

1、第一部分：端粒縮短影響原發(fā)性高血壓及其并發(fā)癥的發(fā)生
　　 目的：建立包括Q-FISH、Flow-FISH、Southern Blot和RT-PCR等多種檢測(cè)細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的技術(shù)平臺(tái)；并選擇其中一種方法檢測(cè)767例原發(fā)性高血壓人群和正常對(duì)照人群5年前后外周血單個(gè)核細(xì)胞端粒長(zhǎng)度，試圖明確端粒長(zhǎng)度與原發(fā)性高血壓之間的關(guān)系。
　　 方法：制備mTerc-/-小鼠及正常野生型小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液，用端粒特異的FITC-PNA探針

2、標(biāo)記后激光共聚焦顯微鏡觀察熒光數(shù)目及強(qiáng)度；制備mTerc-/-小鼠及正常野生型小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液，用端粒特異的FITC-PNA探針標(biāo)記后流式細(xì)胞儀分析并計(jì)算細(xì)胞熒光強(qiáng)度；提取mTerc-/-小鼠及正常野生型小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞基因組DNA，以293T細(xì)胞基因組DNA為標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)RT-PCR方法測(cè)定細(xì)胞端粒相對(duì)長(zhǎng)度；提取人外周血單個(gè)核細(xì)胞基因組DNA，HinfⅠ和RsaⅠ酶切后經(jīng)Southern Blot方法測(cè)定細(xì)胞端粒絕對(duì)長(zhǎng)度；

3、提取900例人外周血單個(gè)核細(xì)胞基因組DNA，通過(guò)RT-PCR方法測(cè)定細(xì)胞端粒相對(duì)長(zhǎng)度。
　　 結(jié)果：Flow-FISH方法測(cè)得mTerc-/-小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞端粒相對(duì)長(zhǎng)度為0.5345，RT-PCR方法測(cè)得mTerc-/-小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞端粒相對(duì)長(zhǎng)度為0.5717，其結(jié)果基本一致；SouthemBlot方法測(cè)得10例人外周血單個(gè)核細(xì)胞端粒絕對(duì)長(zhǎng)度與RT-PCR方法所測(cè)端粒相對(duì)長(zhǎng)度結(jié)果基本一致，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有高度相關(guān)性(

4、P＜0.01)：RT-PCR方法測(cè)得767例人外周血單個(gè)核細(xì)胞端粒相對(duì)長(zhǎng)度，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明原發(fā)性高血壓組平均端粒長(zhǎng)度（中位數(shù)=0.57，IQR=0.48to0.72）較正常對(duì)照組(中位數(shù)=0.67，IQR=0.53to0.93)短，兩者有顯著性差異(P＜0.001)；所有研究對(duì)象端粒長(zhǎng)度隨年齡增加而下降，但原發(fā)性高血壓組端粒長(zhǎng)度下降速率較快(P=0.038)；所有研究對(duì)象中在5年內(nèi)發(fā)生冠脈疾病者平均端粒長(zhǎng)度與未發(fā)病者相比較短(P＜0.0

5、01)，原發(fā)性高血壓組在5年內(nèi)發(fā)生冠脈疾病者平均端粒長(zhǎng)度與未發(fā)病者相比較短(P=0.031)：正常對(duì)照組在5年內(nèi)發(fā)生冠脈疾病者平均端粒長(zhǎng)度與未發(fā)病者相比較短(P＜0.001)。
　　 結(jié)論：成功建立了檢測(cè)細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的Q-FISH、Flow-FISH、Southern Blot和RT-PCR技術(shù)平臺(tái)，其結(jié)果穩(wěn)定可靠，具有高度相關(guān)性，適用于不同樣本來(lái)源的細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的檢測(cè)。對(duì)767例原發(fā)性高血壓人群和正常對(duì)照人群5年前后外周血單個(gè)

6、核細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的檢測(cè)結(jié)果提示，人外周血單個(gè)核細(xì)胞的端粒縮短不但是原發(fā)性高血壓發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素，而且還影響了高血壓并發(fā)癥的發(fā)生：端?？s短可以作為生物衰老和發(fā)生衰老相關(guān)疾病的生物學(xué)標(biāo)記之一。該部分實(shí)驗(yàn)首次驗(yàn)證了端?？s短與高血壓預(yù)后的因果關(guān)系。
　　 第二部分：shRNA重組慢病毒載體在小鼠造血系統(tǒng)內(nèi)的長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)
　　 目的：構(gòu)建可高效感染小鼠造血干細(xì)胞的shRNA重組慢病毒載體，并研究其在小鼠造血系統(tǒng)中的長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。<

7、br>　　 方法：用SFFV啟動(dòng)子更換p-CMV慢病毒載體中的CMV啟動(dòng)子，將p-CMV和重組并鑒定正確的p-SFFV慢病毒載體與輔助病毒載體PAX2和PMD2G混合后，采用磷酸鈣方法共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞，獲得具有感染能力的成熟慢病毒；經(jīng)超速離心獲得高滴度的病毒懸液，體外感染經(jīng)流式細(xì)胞儀分選并體外培養(yǎng)的小鼠骨髓造血干細(xì)胞；流式分析其表達(dá)效率后，選取感染效率較高的p-SFFV慢病毒載體感染小鼠骨髓造血干細(xì)胞，并通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性骨髓移植技術(shù)輸

8、入放射線照射后的免疫抑制小鼠體內(nèi)；在移植后4周和9周分別獲取小鼠外周血樣本，移植后16周獲取小鼠骨髓樣本，分析供體細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的表達(dá)。
　　 結(jié)果：成功重組了p-SFFV慢病毒載體并使其在小鼠骨髓造血干細(xì)胞中高效表達(dá)（感染效率72.4％）；骨髓移植實(shí)驗(yàn)表明攜帶外源性shRNA的慢病毒載體可在小鼠造血系統(tǒng)內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)（骨髓移植16周后骨髓單個(gè)核細(xì)胞感染效率92%）。
　　 結(jié)論：shRNA重組慢病毒載體在小鼠造血系統(tǒng)中

9、可長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。
　　 第三部分：通過(guò)shRNA慢病毒載體庫(kù)體外篩選干細(xì)胞衰老相關(guān)功能基因
　　 目的：擴(kuò)增包含靶向人類(lèi)1000個(gè)衰老相關(guān)基因?qū)?yīng)的2400個(gè)shRNA克隆的慢病毒載體庫(kù)，將其導(dǎo)入可被Dox誘導(dǎo)發(fā)生二次重編程的iPS嵌合體小鼠皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)體系中，觀察iPS克隆形成的效率。
　　 方法：將所選的慢病毒載體庫(kù)隨機(jī)分配到三個(gè)組合中，制備轉(zhuǎn)化效率較高的超級(jí)感受態(tài)細(xì)菌，檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率并擴(kuò)增慢病毒載體庫(kù)；

10、分離并培養(yǎng)可被Dox誘導(dǎo)發(fā)生二次重編程的iPS嵌合體小鼠原代皮膚成纖維細(xì)胞；通過(guò)293T包裝細(xì)胞包裝成熟慢病毒顆粒，體外感染細(xì)胞后加入Dox連續(xù)誘導(dǎo)21天，使其去分化形成iPS克隆。利用SSEA-1熒光抗體表面標(biāo)記iPS細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分選后提取細(xì)胞DNA，進(jìn)行深度測(cè)序，初步篩選目的基因。
　　 結(jié)果：成功制備轉(zhuǎn)化效率較高的超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞，分離并體外培養(yǎng)了可被Dox誘導(dǎo)發(fā)生二次重編程的iPS嵌合體小鼠原代皮膚成纖維細(xì)胞；形成iP