組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志谹抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)作用機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤,在西方國(guó)家發(fā)病率(50/10萬(wàn))與死亡率位居惡性腫瘤的前3位;在亞洲,結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì);在我國(guó),結(jié)腸癌的發(fā)病率僅次于胃癌、肺癌和食道癌,排名第4位,患者5年中位生存率不足40％。研究資料顯示,我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率與死亡率將在今后很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)呈快速上升趨勢(shì),將成為常見(jiàn)而高發(fā)的惡性腫瘤。因此,深入探究結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制,尋找有效的化學(xué)治療藥物己成為抗結(jié)腸癌研究重要而緊迫的任務(wù)。目前,普遍認(rèn)為結(jié)腸癌發(fā)病是一個(gè)

2、多基因、多環(huán)節(jié)的復(fù)雜過(guò)程,其中涉及多個(gè)癌基因激活和抑癌基因失活。p53是一個(gè)重要的抑癌基因,它主要通過(guò)調(diào)控下游基因發(fā)揮作用。p53蛋白可以促進(jìn)p21和Bax基因的表達(dá),引起細(xì)胞周期阻滯和凋亡發(fā)生。很多抗腫瘤藥物通過(guò)p53依賴途徑發(fā)揮作用,但是臨床研究發(fā)現(xiàn),有接近50%的腫瘤患者存在p53突變以及其功能缺失。曲古抑菌素A(TrichostatinA,TSA)是一種強(qiáng)效、特異而可逆的組蛋白去乙?；敢种苿?可以抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),誘導(dǎo)細(xì)胞

3、周期阻滯,促進(jìn)細(xì)胞分化及細(xì)胞凋亡。盡管國(guó)內(nèi)外對(duì)TSA的抗腫瘤作用已經(jīng)進(jìn)行了一些研究,但其抗腫瘤的作用機(jī)制仍然有待進(jìn)一步闡明。本課題通過(guò)觀察TSA對(duì)HCT116p53(+/+)和HCT116p53(-/-)結(jié)腸癌細(xì)胞,以及p53突變型結(jié)腸癌HT29細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的作用,同時(shí)分析TSA對(duì)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)分子PAPP,caspase3、Bax、Bcl-2、Bcl-xL、MCL1和Ku70的調(diào)控作用,深入探究TSA引起細(xì)胞周期阻滯,

4、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。本課題的研究,將進(jìn)一步豐富TSA的抗腫瘤作用機(jī)制,并為組蛋白去乙酰化酶抑制劑用于結(jié)腸癌的化學(xué)預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。
　　目的:1.觀察TSA對(duì)細(xì)胞周期、對(duì)細(xì)胞凋亡的影響,探討p53依賴、非依賴途徑在TSA引起細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡中的作用。2.通過(guò)檢測(cè)TSA對(duì)Bax啟動(dòng)子活性的調(diào)控作用和對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)分子PAPP、caspase3、Bax、Bcl-2、Bcl-xL、MCL1表達(dá)及線粒體膜電位的影響,深入探究T

5、SA誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制;3.通過(guò)檢測(cè)TSA對(duì)Ku70乙?；约癇ax轉(zhuǎn)位的影響,闡明Ku70乙?；赥SA誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡中的作用。
　　方法:實(shí)驗(yàn)一以HCT116p53(+/+)、HCT116p53(-/-)細(xì)胞及突變型p53基因的HT29細(xì)胞為研究對(duì)象,經(jīng)過(guò)不同濃度(0、0.1、1、5μM)的TSA處理24h后,采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡;啟動(dòng)子實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TSA對(duì)p21活性的影響;Westernblott

6、ing分析TSA對(duì)乙?；痯53和p21蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)二以表達(dá)野生型p53基因的HCT116細(xì)胞的和突變型p53基因的HT29為研究對(duì)象,分別用不濃度(0、0.1、1、5μM)的TSA處理,以流式細(xì)胞儀和Westernblotting檢測(cè)細(xì)胞凋亡;采用Mitotracker染料觀察活細(xì)胞線粒體膜電位變化;Westernblotting方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)分子PAPP、caspase-3、Bax、Bcl-2、Bcl-xL和MCL1的表

7、達(dá);啟動(dòng)子實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TSA對(duì)Bax活性的影響;BaxsiRNA技術(shù)檢測(cè)Bax表達(dá)水平和PARP剪切情況。實(shí)驗(yàn)三以表達(dá)野生型p53基因的HCT116細(xì)胞的和突變型p53基因的HT29細(xì)胞為研究對(duì)象,給予不同濃度(0、0.1、1、5μM)的TSA處理,采用免疫熒光染色法觀察在不同的時(shí)間點(diǎn)(0h、1h、4h、18h)Ku70分布的變化;IP-Westernblotting方法檢測(cè)TSA對(duì)Ku70乙?；淖饔?Westernblotting方法檢

8、測(cè)經(jīng)TSA處理6h和18h后胞漿中和線粒體中Bax表達(dá)量的變化;Ku70siRNA技術(shù)檢測(cè)Bax表達(dá)水平和PARP剪切情況。
　　結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一1.TSA可濃度依賴性地誘導(dǎo)HCT116p53(+/+)、HCT116p53(-/-)細(xì)胞及突變型p53的HT29細(xì)胞發(fā)生G2/M周期阻滯。2.TSA可濃度依賴性地增加p53陽(yáng)性HCT116細(xì)胞的乙?；痯53和p21蛋白表達(dá),同時(shí)促進(jìn)p21啟動(dòng)子的活性;而TSA對(duì)p53陰性的HCT116細(xì)胞

9、的乙?；痯53和p21蛋白表達(dá)及p21啟動(dòng)子激活無(wú)明顯影響。3.TSA可濃度依賴性誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡,p53陽(yáng)性細(xì)胞凋亡率顯著大于p53陰性細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)二1.TSA濃度依賴性誘導(dǎo)HCT116和HT29細(xì)胞凋亡,其中HCT116細(xì)胞凋亡率顯著高于HT29細(xì)胞。2.TSA可濃度依賴性地降低兩種細(xì)胞線粒體膜電位,同時(shí)濃度依賴性激活caspase-3。3.兩株細(xì)胞經(jīng)TSA處理后,Bax蛋白的表達(dá)均顯著性增加而B(niǎo)cl-2和Bcl-xL的表達(dá)均顯著性

10、減少,且呈濃度依賴性;TSA對(duì)兩株細(xì)胞中MCL1蛋白表達(dá)均無(wú)顯著性影響。4.p53陽(yáng)性和陰性HCT116細(xì)胞經(jīng)TSA處理后,其Bax的轉(zhuǎn)錄活性均濃度依賴性增高。5.p53野生型和突變型細(xì)胞經(jīng)TSA處理后,Bax表達(dá)量和PARP剪切片段顯著性增加;用BaxsiRNA使Bax表達(dá)下調(diào)后,PARP剪切片段顯著性減少,表明細(xì)胞凋亡減少。實(shí)驗(yàn)三1.TSA處理HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞1h后,部分Ku70由胞核向胞漿轉(zhuǎn)位;4h開(kāi)始再向細(xì)胞核中分

11、布,到18h,胞漿中仍有少量Ku70,HCT116胞漿中的少量Ku70形成顆粒狀。2.兩株細(xì)胞經(jīng)TSA處理后,乙酰化Ku70表達(dá)均顯著性增加。3.兩株細(xì)胞在TSA處理6h后,胞漿中Bax表達(dá)顯著性減少而線粒體中表達(dá)顯著性增加;18h后這種趨勢(shì)更加明顯;細(xì)胞色素C的表達(dá)與Bax恰好相反。4.用Ku70siRNA使兩株細(xì)胞中的Ku70表達(dá)下調(diào)后,經(jīng)TSA處理,Ku70、Bax表達(dá)量及PARP剪切片段均顯著性減少。
　　結(jié)論:1.TSA