多西紫杉醇核酸適配體的高效篩選及其特性的初步考察.pdf

1、核酸適配體作為一種與抗體功能相似的新型配體,它們在疾病檢測、新藥研發(fā)、臨床治療及基因表達調(diào)控等多個領(lǐng)域具有良好的應用前景,成為近年來研究的熱點之一。核酸適配體具有靶分子范圍廣、穩(wěn)定性好、合成簡單、易于修飾等特點。小分子目標物是一類很重要的靶分子,核酸適配體對小分子的特異性識別在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品安全和環(huán)境監(jiān)測等方面都有著廣泛的應用前景。但是小分子核酸適配體的篩選面臨費時費力、成本高、篩選結(jié)果不理想等技術(shù)瓶頸,制約了它們的發(fā)展和應用。

2、>　　與此同時,微流控芯片作為一種新型的化學、生物分析檢測平臺得到了快速發(fā)展。因其具有快速、高效、高通量、低成本、低樣品量、微型化、集成化等優(yōu)點,特別是在分離領(lǐng)域具有獨特的優(yōu)勢,所以越來越多地被用于核酸適配體的篩選。
　　本論文以多西紫杉醇(DOC)作為篩選的靶分子,采用固定文庫的篩選方法,同時搭建微流控芯片作為篩選平臺,發(fā)展了一種簡便、高效、易于操作的篩選小分子核酸適配體的方法,并對篩選得到的核酸適配體的特性進行了初步考察。研究

3、內(nèi)容包括:
　　(1)為了簡化整個篩選流程、提高篩選效率,設(shè)計了一種操作簡便,無需外加分離裝置的蛇形通道微流控芯片。首先在芯片表面利用生物素化捕獲探針通過互補雜交的方式將DNA文庫固定于通道表面,再通入目標物多西紫杉醇的溶液,與目標物結(jié)合的DNA鏈將被洗脫下來,并在芯片出口處被收集。經(jīng)過九輪的篩選,并對富集度較高的第五、六、七輪文庫進行了TA克隆測序。
　　(2)通過序列分析和親和力、特異性的考察,獲得了兩條與多西紫杉醇親和

4、力和特異性較好的核酸適配體DOC6-5和DOC7-38,其解離常數(shù)分別為32nmol/L和66nmol/L,并初步推測核酸適配體有兩個位點可與多西紫杉醇結(jié)合。此外,還考察了不同輪數(shù)的DNA文庫對多西紫杉醇的增溶作用,富集度高的文庫增溶作用比較明顯,篩選出的核酸適配體DOC6-5可使多西紫杉醇的溶解度從5μg/mL增加到20μg/mL,且DOC6-5與多西紫杉醇復合物在水溶液中能夠穩(wěn)定存在。通過MTT實驗和PI染色實驗分別考察了DOC6-