Twist基因下調對Caski細胞株化療敏感性改變的機制研究.pdf

1、第一部分 Twist基因的shRNA干擾表達載體的構建和穩(wěn)定轉染宮頸癌細胞株的建立
　　目的:
　　通過構建Twist基因的pRNAT-U6.1/Neo/shRNA真核表達載體，建立穩(wěn)定低表達Twist基因的宮頸癌Caski細胞株，為探討Twist基因影響宮頸癌對紫杉醇的耐藥性及其機制的研究提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.針對Twist基因構建4組真核表達載體，并對重組載體進行酶切鑒定和測序。
　　2.

2、經 Lipofectamine2000脂質體將pRNAT-U6.1/Neo-Twist-shRNA重組質粒穩(wěn)定轉染至人宮頸癌 Caski細胞中，G418篩選，通過熒光顯微鏡觀察轉染細胞的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP)表達情況，確定轉染成功。
　　3.擴大培養(yǎng)，從而建立穩(wěn)定細胞株Caski-Twist-shRNA。
　　4.應用RT-PCR方法檢測穩(wěn)定細胞株Caski-Twist-s

3、hRNA中Twist mRNA的表達情況，鑒定干擾效果并篩選出轉染效率最佳的shRNA。
　　結果:
　　1.經雙酶切圖及測序檢測，成功構建重組載體pRNAT-U6.1/Neo-Twist-shRNA。
　　2.重組載體經脂質體Lipofectamine2000穩(wěn)定轉染Caski細胞，熒光顯微鏡顯示獲得穩(wěn)定單克隆細胞株Caski-Twist-shRNA。
　　3. RT-PCR方法鑒定其干擾效果，以Twist擴增

4、產物(489bp)與內參照β-actin(600bp)的比值來表示Twist mRNA的變化，空白對照組和陰性對照組比較差異無顯著性（P>0.05)，轉染組1、轉染組2、轉染組3、轉染組4均與空白對照組和陰性對照組比較差異有顯著性(P<0.05)，表明成功建立穩(wěn)定干擾 Twist基因表達的Caski-Twist-shRNA細胞系。轉染組2與轉染組1、轉染組3、轉染組4比較差異有顯著性(P<0.05)，表明轉染組2的轉染效率最佳。后續(xù)實驗

5、應用轉染組2進行實驗。
　　結論：
　　1.成功構建重組質粒pRNAT-U6.1/Neo-Twist-shRNA。
　　2.成功建立穩(wěn)定低表達Twist基因的Caski-Twist-shRNA細胞株。
　　第二部分 Twist基因下調對Caski細胞株化療敏感性改變的機制研究
　　目的：
　　探討Twist基因下調對Caski細胞株化療敏感性改變的機制研究。
　　方法：
　　1. MTT實

6、驗分為三組：空白對照組（即未轉染組，Caski）、陰性對照組（即轉染 NC組，Caski-shRNA-NC）和實驗組（Caski-Twist-shRNA2）。經不同濃度（0.25、0.5、1、2、4μmol/L）紫杉醇處理48小時后，用MTT比色法檢測各組細胞的OD值，并計算IC50值，篩選出紫杉醇最佳抑制濃度。
　　2. Western-blot實驗分為四組：空白對照組(Caski)、正常對照組（Caski+Taxol）、陰性對

7、照組（Caski-shRNA-NC+Taxol）和實驗組（Caski-Twist-shRNA2+Taxol）。經Western-blot檢測四組細胞中PI3K和AKT蛋白表達，分析下調Twist基因聯(lián)合紫杉醇處理后的Caski細胞中PI3K和AKT的蛋白表達。
　　結果：
　　1. MTT結果顯示：Twist基因表達下調的細胞（實驗組）在不同紫杉醇濃度下的增殖抑制率與空白對照組、陰性對照組相比均顯著增加（P﹤0.05），實驗

8、組IC50與空白對照組、陰性對照組相比明顯降低（P﹤0.05），紫杉醇最佳濃度為1000μmol/L。
　　2. Western-blot結果顯示：實驗組中PI3K的蛋白表達較陰性對照組、正常對照組和空白對照組均明顯降低(P均<0.05)，實驗組中AKT的蛋白表達較陰性對照組、正常對照組和空白對照組均明顯降低(P均<0.05)，而陰性對照組和正常對照組中PI3K和AKT的表達無明顯差異（P>0.05)。
　　結論：