加熱誘導內皮抑素納米載體靶向治療肝癌的研究.pdf

1、目的： 構建熱誘導型HSP70啟動子調控內皮抑素(Endosmtin，Endo)基因的重組質粒pcDNA3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP，獲得目的基因的靶向表達以及有效的體內調控手段；制備包裹質粒DNA的葡聚糖接枝聚乳酸(DEX-PLA)納米微球，獲得靶向性良好和轉染有效的基因轉運載體；探討加熱誘導調控下納米載體介導的內皮抑素基因治療對肝癌細胞HepG2的體外殺傷作用和體內抑瘤作用。 方法： 采用PC

2、R技術，以肝癌細胞HepG2基因組總DNA為模板，擴增熱誘導型HSP70啟動子片段；自pSP-Endo/EGFP質粒中切取Endo-EGFP融合基因，依次將以上基因序列克隆到真核表達質粒pcDNA3.1(+)，獲得HSP70啟動子調控內皮抑素基因的重組質粒pcDNA31(+)/HSP70-Endo/EGFP。 采用化學偶聯(lián)法合成葡聚糖接枝聚乳酸(DEX-PLA)聚合物。用水/油/水(W/O/W)雙乳化有機溶劑蒸發(fā)法制備載DNA納

3、米微球，透射電子顯微鏡觀察納米微球的形態(tài)，動態(tài)光散射儀檢測納米微球的粒徑分布，用DNase Ⅰ消化實驗檢測納米載體對DNA的保護作用。 用載DNA納米微球轉染肝癌細胞HepG2，以Lipofectamine<'TM> 2000作為對照；轉染48h后不同溫度下加熱誘導HSP70啟動子調控Endostatin基因的表達，流式細胞術檢測載DNA納米微球在肝癌細胞HepG2中的轉染效率，RT-PCR檢測不同溫度誘導對目的基因表達的影響；

4、MTT法檢測Endostatin基因轉染對肝癌細胞HepG2和人臍內皮細胞ECV304細胞增殖的影響。構建肝癌裸鼠移植瘤模型，通過瘤內注射給藥，觀察腫瘤體積的變化，繪制腫瘤生長曲線；處死實驗動物后，HE染色觀察實驗動物腫瘤組織的病理變化。 結果： 成功擴增了熱誘導型HSP70啟動子片段，測序結果與GeneBank中AL671762所提供序列完全一致；構建的重組質粒pcDNA3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP，經

5、雙酶切鑒定無誤。 紅外光譜表征證實聚乳酸支鏈的存在，提示DEX-PLA的形成；包裹重組質粒pcDNA3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP的DEX-g-PLA納米微球，呈球形，粒徑約90-110nm：該載DNA納米微球可有效保護DNA免遭DNase Ⅰ酶破壞。 載DNA/DEX-PLA納米微球可有效的介導基因轉染HepG2細胞，其轉染效率略低于脂質體，而生物相容性則明顯優(yōu)于脂質體；低溫加熱可有效誘導目的基因的高表達

6、，43℃/30min時最明顯，較未加熱組高3-3倍；RT-PCR證實mRNA水平的表達在加熱誘導組與未加熱組存在顯著差異；MTT證實Endostatin基因可有效抑制ECV304的生長，熱誘導后更明顯，而對HepG2細胞增殖無明顯影響。 體內試驗表明，載Endostatin基因納米微球可抑制腫瘤的生長，并進一步縮小腫瘤體積，HE染色顯示治療組腫瘤組織內有明顯的壞死灶。 結論： 擴增的ItSP70啟動子具有良好的熱

7、誘導性，低溫加熱誘導可有效誘導其下游基因的表達，可作為靶向基因治療的分子開關； DEX-PLA納米微球對DNA有較好的保護能力和轉基因能力； DEX-PLA納米微球介導pcDNA3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP轉染對人臍內皮細胞ECV304較好的殺傷作用，低溫加熱誘導有明顯增效作用； DEX-PLA納米微球介導pcDNA3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP瘤內轉染對肝細胞癌有明顯的抑瘤作用，熱