水稻黃單胞菌gacA、ppsA和zur基因的克隆及功能分析.pdf

1、水稻黃單胞菌包含兩個致病變種Xanthomonas orzae pv.oryzae(Xoo)和X.oryzae pv.oryzicola(Xooc)，在水稻上分別引起白葉枯病和細菌性條斑病。本研究對水稻黃單胞菌gacA、ppsA和zur基因進行克隆與鑒定，并對基因進行序列分析。用同源重組的方式構建相應基因的插入突變株，通過與野生型菌株進行表型比較來推知基因相應功能。 (一)根據(jù)已公布基因組的X.axonopodis pV.ci

2、trf(Xac)和X.campestris pv.campestris(Xcc)的gacA基因序列，設計簡并引物GF/GR，采用PCR的方式從Xoo菌株PXO99和Xooc菌株RsGD42染色體中擴增了gacA基因的同源片斷。核酸序列分析表明，gacA基因全長648bp，編碼215個氨基酸的蛋白。Xoo和Xooc gacA基因只有2個堿基的差別。在與其它種gacA基因比較發(fā)現(xiàn)其在Xanthomonas屬中是保守的。NCBI網(wǎng)站蛋白保守域

3、搜索結果表明，GacA屬于LuxR蛋白家族相似蛋白的一員。其具有一個CheB結構功能域，可能參與調(diào)控細菌的趨化性。 以引物XOR1/XOR2擴增gacA基因的內(nèi)部片斷，連接于PMD18-T，獲得重組質粒pXOR和pXORs，電擊轉化質粒于野生型菌株電轉感受態(tài)細胞中。通過單交叉同源重組的方式將重組質粒整合入基因組染色體中獲得突變株。PCR和Southern雜交驗證質粒插入的正確性。通過對0.1％Tryptone趨化性的調(diào)控來看，突變株

4、較野生型的趨化性有了一定程度的下降。但對其它一些表型的測定結果證明，gacA基因并不是水稻黃單胞菌的全局性調(diào)控子。 (二)水稻白葉枯病菌基因組全序列已公布。通過基因組注釋發(fā)現(xiàn)，Xoo只有一條糖異生路徑，也就是蘋果酸酶－磷酸烯醇式丙酮酸合成酶途徑。本研究通過單交換同源重組的方式構建了磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因(ppsA)的非極性突變體OSPAM。碳源利用檢測顯示，野生型菌株PXO99和互補菌株COSPAM能夠在以檸檬酸、蘋果酸、

5、琥珀酸、延胡索酸、丙酮酸、甘油或乙酸作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基上正常生長，而OSPAM。則不能正常生長。說明PPSA途徑是PXO99在糖異生過程中從四碳二羧酸合成磷酸烯醇式丙酮酸的唯一途徑，這一結果和基因組注釋相符。利用剪葉接種法接種感病寄主汕優(yōu)63，突變體產(chǎn)生的病斑長度明顯低于野生型。寄主葉內(nèi)生長測定結果顯示OSPAM的生長比PXO99低一個數(shù)量級。這些結果表明糖異生過程是白葉枯病菌致病及在寄主體內(nèi)生長必需的。 (三)鋅吸

6、收調(diào)控蛋白(Zur)存在于許多細菌中，當細胞內(nèi)的鋅離子濃度過高 時抑制高親和性鋅吸收系統(tǒng)的表達，避免過量的鋅對細菌產(chǎn)生毒性。在已公布Xoo基因組中沒有注釋zur基因，用大腸桿菌Zur蛋白序列比對Xoo KACC10331基因組，發(fā)現(xiàn)編號為X001505的ORF編碼的蛋白與大腸桿菌的Zur蛋白有41％的同源性。用PCR的方法從XooPX099中克隆了zur同源基因zur<,Xoo>通過整合突變法構建zur<,Xoo>突變株OSZR