內質網應激在內源性心肌細胞保護中的作用及其信號轉導機制研究.pdf

1、心肌缺血是心肌重構和心力衰竭的主要原因，減輕心肌缺血損傷是防治心力衰竭的關鍵，盡早恢復缺血心肌血流是減輕心肌缺血損傷的根本措施。但是，經過一定時間缺血的組織器官在恢復血液灌注后，會出現(xiàn)不可逆性再灌注損傷。探索激發(fā)機體內源性保護機制，減輕缺血再灌注(I/R)損傷是防治心肌缺血的關鍵。缺血預處理(IPC)及缺血后處理(I-postC)是近年發(fā)現(xiàn)的重要內源性保護機制，可明顯縮小缺血心肌的梗死面積，減輕I瓜損傷。探討IPC和I-postC心臟保

2、護的共同及不同機制具有重要的科學意義，并將為其臨床應用提供新的思路。 內質(ER)是真核細胞中重要細胞器，I/R過程中的多種刺激因素，包括缺氧、酸中毒、ATP耗竭、氧化應激、鈣超載等均可導致內質網功能失調，即內質網應激(ERS)。一定程度的ERS可誘導葡萄糖調節(jié)蛋白類(GRPs)、鈣網蛋白(CRT)、折疊酶等ER伴侶分子表達上調，增強ER處理未折疊蛋白的能力，促進 ER 功能恢復；ERS 持續(xù)存在或過強時將誘導caspase-1

3、2、CHOP/GADD153等促凋亡因子的表達/活化，觸發(fā)ER相關性凋亡信號途徑，誘導細胞凋亡。持續(xù)而嚴重的ERS是由I/R誘導并導致組織細胞損傷的重要機制。IPC、I-postC是否可通過調節(jié)ERS反應，增強細胞對應激因素的耐受能力，緩解ER應激程度，從而減輕I/R損傷?本工作采用乳鼠心肌細胞缺氧/復氧(H/R)模型模擬在體I/R損傷，觀察缺氧預處理(HPC)和缺氧后處理(H-postC)對于ER應激分子GRP78、CRT表達及cas

4、pase-12活化的影響及其與心肌細胞保護的關系，并探討HPC和H-postC調節(jié)ERS、介導心肌細胞保護的細胞信號轉導機制。 主要方法與結果如下： 原代培養(yǎng)的Sprague-Dawley乳鼠心肌細胞缺氧2h復氧14h復制H/R模型，HPC組細胞缺氧20min復氧24h后進行H/R操作；H-postC組細胞缺氧2h后先進行3輪5min復氧/5min缺氧的缺氧后處理，再進行持續(xù)復氧14h結束實驗。 1．HPC和H-

5、postC對于心肌細胞H/R損傷的影響采用臺盼藍排斥實驗檢測細胞存活率；采用LDH活性測試盒檢測細胞培養(yǎng)液中LDH漏出情況；采用AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡率。結果顯示：HPC、H-postC可明顯提高H/R心肌細胞的存活率，減輕細胞凋亡和LDH漏出。 2．HPC、H-postC對ERS分子表達/活化的影響采用逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase cha

6、in reaction,RT-PCR)方法檢測細胞GRP78mRNA水平；Western blot分析檢測CRT表達和caspase-12活化水平。結果表明：H/R誘導細胞GRP78mRNA、CRT表達和caspase-12活化上調，HPC及H-postC使H/R細胞GRP 78mRNA上調程度增加，減輕H/R后CRT過表達程度及caspase-12活化水平，但H-postC對H/R心肌細胞caspase-12活化的抑制效果較HPC差。

7、 3．HPC、H-postC調節(jié)ERS的信號途徑研究于HPC、H-postC前應用p38MAPK特異性抑制劑SB203580及JNK特異性抑制劑SP600125，分別在HPC及H-postC處理前加入細胞培養(yǎng)液(終濃度分別為5μmol/L、25μmol/L，37℃預孵育5-10min)。結果顯示：(1)HPC前應用SB203580可明顯抑制CRT表達上調并明顯減弱HPC抑制caspase-12活化、減輕心肌細胞H/R損傷的作用；

8、而應用SP600125對CRT表達和caspase-12活化水平和HPC的心肌細胞保護作用均無明顯影響。(2)H-postC前應用SB203580可明顯抑制CRT表達上調，并降低H-postC對細胞H/R損傷的保護，但僅輕度減弱H-postC對caspase-12活化的抑制作用；H-postC前應用SP600125對CRT表達及H-postC細胞保護作用未產生明顯影響，但可進一步降低caspase-12的活化水平。 結論：HPC