抗稻瘟病Pib基因啟動(dòng)區(qū)結(jié)構(gòu)、功能分析和轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證研究.pdf

1、作為轉(zhuǎn)錄水平上一種重要的調(diào)控元件，啟動(dòng)子控制著基因在特定組織、特定發(fā)育階段以及一定環(huán)境條件下的表達(dá)。pib基因是利用圖位克隆技術(shù)從水稻中克隆出的第一個(gè)抗稻瘟病主效基因，屬于NBS-LRR抗病基因家族，前人研究表明該基因的表達(dá)受環(huán)境和化學(xué)因素誘導(dǎo)。pib基因表現(xiàn)出的這些特殊性是否與結(jié)構(gòu)基因上游的啟動(dòng)區(qū)域有關(guān)，啟動(dòng)子活性及其中的誘導(dǎo)響應(yīng)元件是否對(duì)該基因表達(dá)產(chǎn)生影響等相關(guān)研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，分離、鑒別pib基因啟動(dòng)子，了解其時(shí)空表達(dá)特性及作

2、用機(jī)制，將為基因表達(dá)調(diào)控的研究及抗病育種提供重要的理論依據(jù)。本文將報(bào)道周轉(zhuǎn)基因技術(shù)平臺(tái)和報(bào)告基因體系對(duì)pib結(jié)構(gòu)基因上游區(qū)域的啟動(dòng)活性和誘導(dǎo)特性的初步研究結(jié)果。 1．序列分析和酶切檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，pib基因是正向連接在pBluescript SKi(+)載體的Not I位點(diǎn)，基因內(nèi)部存在117個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。結(jié)構(gòu)基因區(qū)包含4個(gè)內(nèi)含子、3個(gè)外顯子，ATG上游區(qū)包含3.6 kb啟動(dòng)區(qū)域。用PLACE軟件對(duì)pib基因啟動(dòng)區(qū)預(yù)測(cè)

3、分析發(fā)現(xiàn)，ATG上游、下游鄰近區(qū)段存在大多數(shù)啟動(dòng)子的保守元件和受各種因素誘導(dǎo)的響應(yīng)元件。 2．選擇含有g(shù)us基因的雙元載體pCAMBIA1301，將酶切和PCR擴(kuò)增獲得的pib基因啟動(dòng)區(qū)的不同片段：35～2398 bp(2.36Kb)、2398～3962 bp(1.56Kb)、2630～3959bp(1.3Kb)和35～5769bp(5.7Kb)分別連接進(jìn)pCAMBIA1301中g(shù)us基因前，取代原來(lái)的CaMV35S啟動(dòng)子，分別

4、構(gòu)建成重組質(zhì)粒pNAR601、pNAR602、pNAR603和pNAR604。其中604包含pib基因啟動(dòng)子ATG上游全部和下游的部分區(qū)域，601、602和603均是不同程度的缺失片段。經(jīng)過(guò)酶切驗(yàn)證后，轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌菌株EHA101中。 3．利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將上述分別含有pNAR601(pNAR602、pNAR603或pNAR604)／農(nóng)桿菌的構(gòu)建轉(zhuǎn)化粳稻品種R109，同時(shí)轉(zhuǎn)化CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS的pCAMBIA1

5、301／農(nóng)桿菌做比較研究。共獲得106株再生植株，經(jīng)潮霉素、PCR篩選確定得到61個(gè)陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因水稻植株，陽(yáng)性率57.5％。潮霉素篩選種子和Southern blot等檢測(cè)都表明目的基因已經(jīng)整合到水稻基因組中。 4．以上述獲得的包含各個(gè)載體的61轉(zhuǎn)基因植株為材料，用GUS染色和熒光定量分析的方法，分別在蛋白水平檢測(cè)目的基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)。對(duì)全長(zhǎng)啟動(dòng)子(604)和片段(601)驅(qū)動(dòng)gus基因的T<,0>代植株組織化學(xué)研究結(jié)果

6、表明，光照培養(yǎng)下的抗性愈傷和轉(zhuǎn)基因植株根加X(jué)-gluc不顯色，而暗處理24 h后的抗性愈傷和定植后轉(zhuǎn)基因植株的根加X(jué)-gluc后顯藍(lán)色。轉(zhuǎn)基因植株Gus熒光定量分析結(jié)果表明，GUS表達(dá)具有器官特異性，含pNAR604質(zhì)粒的植株，黑暗處理前根的Gus活性最高、莖次之，分別是葉片的7倍和3倍，葉片中僅有痕量本底，24h黑暗處理后根、莖、葉中GUS活性都有增加，且葉片中的增加比例最大；含pNAR601、pNAR602和pNAR603質(zhì)粒的植株

7、黑暗誘導(dǎo)后根、莖葉中的GUS活性也分別有相應(yīng)的增加。初步確定pib擬啟動(dòng)區(qū)是一個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，黑暗能誘導(dǎo)該啟動(dòng)子啟動(dòng)活性。含pNAR601、pNAR602、pNAR603和pNAR604質(zhì)粒的植株之間相比，黑暗誘導(dǎo)24 h后，GUS活性在含pNAR604的植株中最高、pNAR601次之、pNAR603最小，初步判斷pib啟動(dòng)區(qū)較長(zhǎng)的片段驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)活性較強(qiáng)。 5.5 mmol／L水楊酸和0.3 mol／L Nacl葉面噴施含