解淀粉芽孢桿菌SWB16脂肪酶基因的克隆、表達及活性檢測.pdf

1、家蠶是一種鱗翅目模式昆蟲，也作為經(jīng)濟性昆蟲為養(yǎng)蠶業(yè)帶來了豐厚的收入。但是蠶病的發(fā)生嚴重制約了蠶桑業(yè)的發(fā)展，特別是家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）感染導(dǎo)致的血液型膿病，是生產(chǎn)中危害最嚴重的一類病毒病。家蠶在自然進化中發(fā)展出物理阻隔、體液免疫和細胞免疫三道防線來抵抗病原體的侵染。家蠶脂肪酶作為家蠶腸道中的抗病毒蛋白，在家蠶對BmNPV體液免疫中發(fā)揮作用已最先被日本研究人員證實

2、。國內(nèi)學者發(fā)現(xiàn)野蠶腸道脂肪酶同樣具有抗BmNPV活性，并在體外純化獲得了有抗BmNPV活性的野蠶脂肪酶。此外，有研究團隊還建立了增量表達 Bmlipase-1的轉(zhuǎn)基因家蠶品系，有效提高了家蠶對 BmNPV的抵抗力。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)家蠶分別以桑葉和柘葉飼養(yǎng)時，其抗BmNPV的能力顯著不同，其中柘葉飼養(yǎng)會降低家蠶對BmNPV的抵抗力。進一步研究發(fā)現(xiàn)，柘葉飼養(yǎng)蠶腸道內(nèi)的微生態(tài)優(yōu)勢菌群組成類型與桑葉飼養(yǎng)蠶差別較大，且優(yōu)勢菌群豐度降低；腸道內(nèi)

3、脂肪酶產(chǎn)生菌的種類也明顯不如桑葉飼養(yǎng)蠶腸道中的脂肪酶產(chǎn)生菌豐富；消化液中的脂肪酶、胰蛋白酶等抗病毒蛋白的活性亦低于桑葉飼養(yǎng)蠶。上述研究暗示，家蠶腸道菌產(chǎn)生的脂肪酶也可能參與了家蠶對BmNPV的免疫活動，甚至外源微生物所產(chǎn)脂肪酶也可能有此功效。為獲得大量高純度微生物源脂肪酶，本實驗選擇產(chǎn)脂肪酶的藥用植物內(nèi)生菌解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens SWB16為研究對象，克隆、原核表達其脂肪酶，采用Ni-NTA法

4、進行純化，并檢測其活性及含量，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴以SWB16 DNA為模板，利用引物LIP-F和LIP-R進行PCR擴增，成功克隆出SWB16 Lipase基因，其完整ORF長645bp，共編碼214個氨基酸。根據(jù)預(yù)測，該脂肪酶理論分子量為22.73 kDa，等電點為9.82，屬于堿性蛋白。SWB16脂肪酶的N端有2個跨膜域，其中第7到第29位氨基酸為第一個跨膜域，第39到第61位氨基酸為第二個跨膜

5、域，但不存在 N糖基化位點。進一步分析其二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)SWB16脂肪酶具有大量無規(guī)則卷曲和延伸片段及少量的α螺旋、β折疊結(jié)構(gòu)，其中第33-134個氨基酸之間為該蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對分析該脂肪酶的功能結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)第36-180位氨基酸屬于脂肪酶家族 Lipase-2，并且在39-138個氨基酸之間存在α/β水解酶家族的保守序列，說明SWB16脂肪酶蛋白屬于α/β水解酶家族，具有脂肪酶的特有結(jié)構(gòu)和功能。⑵采用pET28a

6、表達載體進行Lipase基因的亞克隆，成功構(gòu)建pET28-lipase重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）后進行原核誘導(dǎo)表達，最佳誘導(dǎo)條件是20 ℃，100 r/min，0.1mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)12h。SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)目的蛋白在37 ℃、28 ℃和20 ℃時均主要以包涵體形式表達，也能夠可溶表達。⑶利用Ni-NTA親和層析分離表達的HIS-LIPASE融合蛋白，經(jīng)超濾濃縮獲得純化的脂肪酶。通過羅丹明 B