胰島對胰腺干細胞促成熟作用及機制的實驗研究.pdf

1、研究目的：
　　 1.以成年大鼠作為實驗對象，采取自膽總管逆行灌注膠原酶-V消化胰腺并用Ficoll進行梯度離心的方法獲取純化的胰島，檢測胰島的產(chǎn)量、純度、存活率及生物學活性，以確定胰島分離及純化方法是否適宜可靠。2.以胎鼠作為實驗對象，獲取其胰芽并通過膠原酶消化法取得原代細胞并進行純化后培養(yǎng)，檢測干細胞相關(guān)標志物，確定胰腺干細胞的性質(zhì)及分離和培養(yǎng)方法是否可靠。3.在胰腺干細胞傳統(tǒng)誘導培養(yǎng)基內(nèi)加入胰島進行共培養(yǎng)，觀察誘導分化效果

2、并檢測相關(guān)指標，探討其機制?？傊ㄟ^以上研究，為胰腺干細胞移植治療糖尿病應用于臨床提供實驗支持和理論基礎。
　　 研究方法：
　　 第一部分：胰島的分離與純化。以成年Wistar大鼠為實驗對象，采取膽總管內(nèi)逆行灌注膠原酶-V的方法消化胰腺，并將獲得的胰島懸液使用Ficoll溶液梯度離心進行純化。而后檢測所得胰島的產(chǎn)量、純度、存活率及培養(yǎng)液中基礎胰島素水平，并進行胰島素釋放試驗，計算胰島刺激指數(shù)。以判斷胰島分離提純方法是

3、否可靠。
　　 第二部分：胰腺干細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定。以胎鼠為實驗對象，取得其胰芽后以膠原酶消化法獲得原代細胞進行培養(yǎng)，并采用差速貼壁的方法進行純化，取傳代后細胞行細胞角蛋白-19(CK-19)、巢蛋白(Nestin)、胰高血糖素(Glucogon)和胰島素(Insulin)等指標的免疫組織化學及RT-PCR檢測。以證實所得細胞的干細胞性質(zhì)，并確定干細胞分離培養(yǎng)方法的可行性與可靠性。
　　 第三部分：胰腺干細胞的誘導分

4、化。選取在第二部分中經(jīng)檢測證實的胰腺干細胞進行誘導分化，實驗共分為三組：胰腺導管干細胞單獨培養(yǎng)組（I組），干細胞，胰島混合培養(yǎng)組（II組）及胰島單獨培養(yǎng)組（III組）。各培養(yǎng)組均采用相同的誘導培養(yǎng)基。共培養(yǎng)組在使用誘導培養(yǎng)基的同時加入50個/孔的胰島（直徑>100um)。在誘導培養(yǎng)過程中測定基礎胰島素水平，進行胰島素釋放試驗并計算胰島素刺激指數(shù)；誘導分化后再次檢測CK-19、Nestin、Glucogon和Insulin等指標，觀察胰腺

5、干細胞誘導分化后的成熟情況，評價混合培養(yǎng)組中胰島對于胰腺干細胞的促成熟作用，并研究其機制。
　　 以上三部分數(shù)據(jù)以x±s表示，以SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。均數(shù)間采用t檢驗，重復測量數(shù)據(jù)以重復測量數(shù)據(jù)的方差分析檢驗，以P<0.05為檢驗水準。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分：大鼠胰島的分離與純化。每只大鼠胰腺可獲得胰島細胞(345±38)個。經(jīng)梯度離心純化后獲得(254±42)個胰島細胞，平均純度為(87±

6、l3)％，平均回收率為74.3％。AO/PI染色后顯示胰島制備物存活率大于95％。所得胰島培養(yǎng)24小時后基礎胰島素為4.21mIU/L，胰島素刺激指數(shù)為2.31。
　　 第二部分：胰腺干細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定。由胎鼠胰芽消化得到原代細胞，通過差速貼壁的方法純化后，可見細胞呈上皮樣貼壁生長良好，多邊形。通過免疫組織化學染色及RT-PCR檢測，結(jié)果示CK-19、Nestin和Glucogon在細胞內(nèi)均有表達，誘導前細胞不表達Insu

7、lin。
　　 第三部分：胰腺干細胞的誘導分化。誘導分化后，干細胞單獨培養(yǎng)組和干細胞-胰島共培養(yǎng)組中除CK-19、Ncstin和Glucogon繼續(xù)表達外，Insulin也開始表達。而且結(jié)果顯示，共培養(yǎng)組表達CK-19及Insulin蛋白的細胞陽性率高于干細胞單獨培養(yǎng)組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)經(jīng)膽總管逆行灌注膠原酶-V并用Ficoll進行梯度離心純化的方法獲取胰島的產(chǎn)率、純

8、度高，存活率滿意，生物活性良好。(2)采用膠原酶消化法消化胎鼠胰芽組織，而后由差速貼壁法進行純化，是獲得胰腺干細胞的可靠方法。(3)自胎鼠胰芽獲得的細胞表達胰腺干細胞的相關(guān)標志物，在蛋白質(zhì)及基因水平驗證了其干細胞性質(zhì)。(4)傳統(tǒng)誘導培養(yǎng)基可誘導小部分胰腺干細胞分化為表達Insulin的相對成熟的B前體細胞。(5)誘導培養(yǎng)基中加入胰島后，可模擬胰腺內(nèi)環(huán)境，通過多種因子作用促進胰腺干細胞成熟。(6)相關(guān)檢測提示，共培養(yǎng)后CK-19在胰腺干細