RNAi特異性抑制ORC1基因?qū)Υ笫笃交〖毎鲋臣凹毎芷诘挠绊?pdf

1、研究背景和目的：血管平滑肌細胞(vascularsmoothmusclecell，VSMC)是血管壁的主要組成部分。VSMC的異常增殖是動脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄等的主要病理基礎(chǔ)。RNA干擾(RNAinterfering，RNAi)作為一種新型的研究基因功能、進行基因治療的工具，它具有高效、高特異性的特點。起始識別復(fù)始物(originrecognitioncomplex，ORC)是細胞DNA復(fù)制中識別復(fù)制起始位點的蛋白質(zhì)，它由6個

2、亞基組成。ORC最早在酵母菌中發(fā)現(xiàn)，之后在多種原核生物、真核生物及人的多種組織、細胞中均發(fā)現(xiàn)有ORC的存在，是各種細胞進行DNA復(fù)制所必須的。當ORC與DNA的復(fù)制起始位點特異結(jié)合后，形成一個平臺，之后cdc6、Cdt1及MCM2-7相繼結(jié)合到ORC上，形成復(fù)制前復(fù)合物。復(fù)制前復(fù)合物在多種蛋白和激酶的作用下活化，促進細胞由G1期進入S期，逐步完成DNA的復(fù)制。細胞通過調(diào)節(jié)ORC的活性來調(diào)控細胞DNA復(fù)制。在芽殖酵母，ORC在整個細胞周期

3、中始終結(jié)合在起始點上；在哺乳動物細胞中，ORC2-6在細胞周期各階段均與染色體結(jié)合，而ORC1在S期卻從核酸上解離下來，直到下一個細胞周期的G1期才重新結(jié)合到染色體上。在真核細胞中ORC1亞基的量在細胞周期中呈現(xiàn)周期性波動(G1中期開始積累，S期開始減少)，而ORC2-6在整個細胞周期保持穩(wěn)定，這種ORC1的周期性波動被稱為“ORC1周期”。ORC1是調(diào)節(jié)ORC活性的關(guān)鍵因素。以前，抑制VSMC生長實驗研究多是從各種信號分子或信號傳導(dǎo)通

4、路的角度來進行探討，以阻斷DNA復(fù)制的起始來抑制VSMC增殖的研究還未見報道。因細胞增殖必須通過DNA復(fù)制把遺傳信息傳遞給子代，細胞DNA的復(fù)制是通過ORC特異地結(jié)DNA復(fù)制起始位點來起動，并通過調(diào)節(jié)ORC的活性來調(diào)控的，而ORC1是調(diào)節(jié)ORC活性的關(guān)鍵因素。基于這一認識，本實驗通過脂質(zhì)介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染大鼠VSMC，對大鼠ORC1基因表達進行RNAi，觀察其對大鼠VSMC細胞增殖及細胞周期的影響，為動脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄提供

5、新的思路和方法。 研究方法： 1.用組織塊貼壁法培養(yǎng)大鼠主動脈VSMC用作體外對ORC1進RNAi、觀察其在細胞增增殖、細胞周期上變化的實驗平臺。用免疫組化檢測α-SM-actin以鑒定VSMC。 2.使用專門設(shè)計用于轉(zhuǎn)染RNA的脂質(zhì)體試劑合對VSMC進siRNA轉(zhuǎn)染。通過RT-PCR、Westernblot技術(shù)觀察RNAi對ORC1的抑制效果。 3.特異性抑制ORC1對大鼠VSMC增殖能力影響的檢測分別

6、用MTT試驗、3H-TdR摻入試驗及免疫組化測定增殖細胞核抗原(PCNA)的量來檢測。 4.特異性抑制ORC1對大鼠VSMC細胞周期影響的檢測用流式細胞儀測定RNAi后不同時相點各細胞周期所占比率來觀察。 研究結(jié)果： 1.本實驗用組織塊貼壁法成功地在體外培養(yǎng)了大鼠VSMC，并經(jīng)免疫化學(xué)證實，為下一步實驗建立了平臺； 2.以3對siRNA轉(zhuǎn)染VSMC，抑制ORC1的mRNA及蛋白質(zhì)效果的檢測選擇了的下一步用

7、于干預(yù)實驗的陽性siRNA。 3.對ORC1進行RNAi后，VSMC增殖能力顯著下降：與未轉(zhuǎn)染組相比，MTT吸光度值由0.3693±0.0264下降至O.1807±0.0398(p＜0.05)，3H-TdR檢測值由12614.20±2375.26下降至2443.20±934.99(p＜0.05)，PCNA陽性細胞率分別由73.74±7.64％下降至28.89±7.34％(p＜0.05)。 4.對ORC1進行RNAi，血清