骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在肝損傷模型小鼠體內(nèi)向肝細(xì)胞分化.pdf

1、研究目的：建立體外分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemesenchymalstemcells，BMSCs)的有效方法，觀察BMSCs能否在有再生需求的小鼠體內(nèi)向肝細(xì)胞分化，以及BMSCs移植能否促進(jìn)肝臟的再生。 方法：以含20％胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，原代細(xì)胞直接貼壁培養(yǎng)，48小時后換液繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長鋪滿后(原代約8-10天，以后5-7天)消化傳代，從雄性BALB/C小鼠骨髓中分離BMSCs。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)

2、及生長特性。流式細(xì)胞儀檢測新鮮分離的骨髓細(xì)胞與第五代的BMSCsCD44與CD29的表達(dá)。 BMSCs移植實(shí)驗動物共50只。除Y染色體陽性對照1只為雄鼠外，其余均為雌鼠，包括Y染色體陰性對照1只，正常對照組16只，模型組16只，BMSCs移植組16只。20％戊巴比妥麻醉后打開腹腔，從肝蒂處結(jié)扎并切除中葉肝臟，移植組肝右葉注射PBS稀釋的源自BALB/C雄性小鼠的BMSCs0.4×105/只，模型組肝右葉注射等體積的PBS后關(guān)閉腹

3、腔。 術(shù)后立即觀察動物進(jìn)食、飲水等一般情況。術(shù)后5日及14日分別處死正常對照組、模型組與BMSCs移植組小鼠各8只。觀察肝臟大體改變；心臟取血，檢測肝功能；稱體重與肝重，計算肝臟臟器指數(shù)；取注射肝葉與非注射肝葉，制備組織芯片，HE染色觀察肝臟病理改變。 BMSCs移植受鼠分別取注射肝葉、非注射肝葉、陽性對照肝組織及陰性對照肝組織制備組織芯片，在同一張芯片上同時用原位雜交檢測Y染色體和免疫熒光檢測白蛋白，在另一張芯片上同時

4、用原位雜交檢測Y染色體和免疫熒光檢測CKl8，在激光共聚焦顯微鏡同一視野下分別激發(fā)FITC與Cy3，利用Lasersharp2000軟件進(jìn)行圖像疊加。同時，另取熒光標(biāo)記的芯片在熒光顯微鏡同一視野下分別激發(fā)FITC與Cy3，用photoshop7.0軟件進(jìn)行圖像疊加。 結(jié)果：原代分離的骨髓細(xì)胞含較多雜細(xì)胞，接種后80分鐘已有細(xì)胞貼壁，48小時后可見貼壁細(xì)胞多數(shù)伸展為紡錘形，呈克隆狀生長。傳代后細(xì)胞大小均勻，形態(tài)一致，部分克隆細(xì)胞平

5、行排列，部分克隆細(xì)胞呈旋渦狀生長。 新鮮分離的小鼠骨髓細(xì)胞98.7％為CD44-CD29-，沒有CD44+CD29+細(xì)胞。第五代的BMSCs有97.4％的細(xì)胞CD29陽性，其中80.8％的細(xì)胞CD44+CD29+，16.6％的細(xì)胞CD44-CD29+。 實(shí)驗動物全部存活，所有動物均于術(shù)后半天內(nèi)開始活動、進(jìn)食及飲水。術(shù)后5日模型組與移植組體重均低于正常對照組，術(shù)后14日各組體重?zé)o顯著差異。術(shù)后14日模型組肝重與臟器指數(shù)顯著

6、低于正常對照組，移植組肝重和臟器指數(shù)與正常對照組相比無顯著差異。 術(shù)后5日模型組與移植組總膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶與谷草轉(zhuǎn)氨酶均與正常對照組相比無顯著差異，總蛋白與白蛋白低于正常對照組而球蛋白高于正常對照組。術(shù)后14日模型組與移植組總膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白與白蛋白均與正常對照組相比無顯著差異，球蛋白低于正常對照組；移植組谷草轉(zhuǎn)氨酶顯著升高，高于模型組與正常對照組。移植組肝臟鏡下偶見血管內(nèi)皮細(xì)胞呈紡錘形，胞漿嗜酸性增強(qiáng)。 移

7、植組小鼠在移植后5天與14天注射肝葉與非注射肝葉內(nèi)均可檢出大量同時表達(dá)Y染色體與白蛋白和/或表達(dá)Y染色體與CK18的陽性細(xì)胞，該細(xì)胞位于肝小葉內(nèi)的肝板中。供鼠來源的肝細(xì)胞多數(shù)以單個細(xì)胞的方式分散存在，但部分細(xì)胞相互鄰近，偶見結(jié)節(jié)狀排列，部分細(xì)胞細(xì)胞核含兩個Y染色體。 結(jié)論：1.以含20％胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，原代細(xì)胞直接貼壁培養(yǎng)，48小時后換液繼續(xù)培養(yǎng)，可很好地從BALB/C小鼠骨髓中分離BMSCs。 2.上述方