STAT1和H2AX基因shRNA慢病毒載體構建及食管癌細胞體外轉染.pdf

1、目的:通過構建食管癌細胞株TE-13和ECA109中的人基因STAT1和H2AX低表達的人食管癌細胞株,觀察人食管癌細胞TE-13、ECA109中STAT1和H2AX在mRNA水平、射線作用前后蛋白質水平和細胞核內斑點表達的變化,為進一步探討抑制STAT1和H2AX基因蛋白表達對食管癌TE-13、ECA109細胞放射敏感性的影響提供理論基礎。
　　 方法:根據(jù)STAT1和H2AX的mRNA序列,STAT1選擇了4個19nts的靶

2、序列,H2AX分別選擇了2個19nts和2個21nts的靶序列設計并合成包含正、反義序列的互補單鏈DNA,同時設計一個無義對照序列。退火后插入pGCSIL載體的H1RNA啟動子后產生pGCSIL-STAT1-shRNA1、pGCSIL-STAT1-shRNA2、pGCSIL-STAT1-shRNA3、pGCSIL-STAT1-sh-RNA4和pGCSIL-H2AX-shRNA1、pGCSIL-H2AX-shRNA2、pGCSIL-H2A

3、X-shRNA3、pGCSIL-H2AX-shRNA4和pGCSIL-negative;以上質粒均需要經(jīng)過PCR和測序鑒定。鑒定正確后,轉染TE13和ECA109細胞,采用western blotting的方法檢測STAT1和H2AX的蛋白表達,比較四種質粒RNA的干擾效果,篩選出RNA干擾效果最佳的質粒,將干擾效果最佳的質粒與慢病毒包裝質?；旌衔锕餐D染293T細胞48h后,收集上清并過濾即為病毒液,該病毒液轉染TE13和ECA109

4、細胞72h后,采用Real-Time PCR和western blotting方法檢測轉染食管癌細胞中基因STAT1和H2AXmRNA水平及蛋白質水平的變化,并采用激光共聚焦顯微鏡檢測細胞核內STAT1和H2AX斑點形成的變化。
　　 結果:①成功地將STAT1和H2AX shRNA與pGCSIL-GFP質粒連接并經(jīng)細菌轉化擴增后,再提取質粒DNA;②STAT1和H2AX shRNA轉染人食管癌細胞珠TE13和ECA109后,其

5、目的蛋白表達水平均下降明顯,pGCSIL-STAT1-shRNA1、pGCSIL-STAT1-shRNA2、pGCSIL-STAT1-sh-RNA3、pGCSIL-STAT1-shRNA4和pGCSIL-H2AX-shRNA1、pGCSIL-H2AX-shRNA2、pGCSIL-H2AX-shRNA3、pGCSIL-H2AX-shRNA4在TE13細胞系較空白對照組分別下降了75％、60％、26％、22％和81％、56％、21％、33％

6、;在ECA109細胞系較空白對照組分別下降了34％、22％、72％、61％和29％、34％、74％、62％;③pGCSIL-STAT1-shRNA1、pGCSIL-H2AX-shRNA3和慢病毒包裝質?；旌衔锕厕D染工具細胞293T細胞,轉染后8h更換為完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)48h后,再收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液,對其濃縮后得到的高滴度慢病毒濃縮液收集上清并過濾為病毒液,該病毒液感染TE13和ECA109細胞72h后,在熒光顯微鏡下出現(xiàn)綠色

7、熒光,熒光率達80％以上,即為人基因STAT1和H2AX蛋白低表達的食管癌細胞株;④對轉染細胞株采用Real-Time PCR和westernblotting方法進行鑒定,結果發(fā)現(xiàn)基因STAT1蛋白低表達的食管癌TE13轉染細胞株在mRNA和蛋白水平上分別下降了73％和69％,基因STAT1蛋白低表達的食管癌ECA109轉染細胞株在mRNA和蛋白水平上分別下降了66％和65％;基因H2AX蛋白低表達的食管癌TE13轉染細胞株在mRNA和

8、蛋白水平上分別下降了66％和83％,基因H2AX蛋白低表達的食管癌ECA109轉染細胞株在mRNA和蛋白水平上分別下降了68％和63％;⑤用轉染的食管癌細胞株應用激光共聚焦顯微鏡檢測細胞核內斑點情況,結果發(fā)現(xiàn)4Gy放射線照射和順鉑處理后細胞核內STAT1和H2AX斑點的形成明顯減少。
　　 結論:采用質粒連接的STAT1和H2AX shRNA轉染TE13和ECA109細胞后,其目的蛋白的表達均被明顯抑制,成功構建了STAT1和H