表皮葡萄球菌基因組比較的生物學功能驗證.pdf

1、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)是條件致病菌，寄居于人體的皮膚和粘膜表面，主要在體內長期留置導管(如中央靜脈插管、腹膜透析等)和接受人工器官(如人工關節(jié)、人工晶體和人工心臟瓣膜等)的患者中引起感染。近年來，其發(fā)病率呈日益上升的趨勢?，F(xiàn)已知道，表皮葡萄球菌的致病性與其在人造高分子材料表面形成細菌生物膜(biofilm，BF)密切相關，生物膜可以保護內部的細菌免受機體免疫應答和抗生素的殺傷作用，從而使得感染

2、遷延不愈。本研究以具有不同生物膜表型和致病能力的2株表皮葡萄球菌為基礎，采用生物信息學對基因組進行了比較分析并對分析結果進行生物學功能驗證；同時對蛋白質組比較中TRAP表達差異的結果進行了生物學驗證，并對trap基因表達與表皮葡萄球菌生物膜形成及附屬基因調節(jié)(agr)系統(tǒng)活化的相關性展開研究；對葡萄球菌雙組分系統(tǒng)進行了初步的探討，并選取srrB/srrA雙組分系統(tǒng)作為研究對象進行初步研究。 第一部分表皮葡萄球菌基因組比較的生物學

3、功能驗證 在表皮葡萄球菌ATCC12228株(無生物膜形成)和ATCC35984株(生物膜形成強陽性)全基因組序列已知的基礎上，我們與上海市生物信息中心合作對2株菌進行了比較基因組學分析。分析結果顯示兩株菌的染色體DNA同源性很高(97﹪)，ATCC35984株基因組中含有較多的重復序列和插入序列，提示穩(wěn)定性較差。兩株菌染色體之間存在約2.0Mb基因片斷的反轉，伴有部分基因的缺失，并含有10,297個單核苷酸多態(tài)性(Single

4、-nucleotidepolymorphisms，SNPs)位點。特異性的PCR擴增和測序結果證明基因組分析的正確性。毒力因子分析顯示ATCC12228株與ATCC35984株含有相似數(shù)目的致病基因，但生物學實驗提示ATCC12228株的部分致病基因(AAP、TRAP、β毒素和δ毒素)在表達水平明顯低于ATCC35984株，可能與致病性的差異相關?？股啬退幍膶嶒灲Y果顯示，ATCC35984株對青霉素、苯唑西林、紅霉素、慶大霉素和阿米卡

5、星等多種抗生素耐藥，而ATCC12228株僅對青霉素和四環(huán)素耐藥，與分析結果相符。 對SNPs位點引起的非同義(non-synonymous，基因突變改變編碼蛋白的性狀)突變與同義突變(synonymous，基因突變不改變編碼蛋白的性狀)比值(N/S)的研究顯示毒力因子和表面蛋白基因的N/S比值明顯偏離總體基因的比值，提示兩者的進化較快，平行于致病環(huán)境的變化。實驗結果證明非同義突變對部分基因產物的功能產生了影響：對甲硫氨酸亞砜還

6、原酶的功能影響通過檢測細菌對H2O2和paraquat(百草枯)等活性氧族(ReactiveOxygenSpecies，ROS)的抵抗力反映，結果顯示不管是在不同濃度的H2O2還是在低于MIC(minimalinhibitoryconcentration，最小抑菌濃度)的百草枯作用下，ATCC35984株的抵抗力均較強；對核糖體蛋白S12的功能影響通過在低濃度鏈霉素作用下細菌形態(tài)的變化進行觀察，革蘭染色結果顯示加入低濃度鏈霉素后ATCC

7、12228株的顏色略偏紅色，并且細胞邊緣模糊，而ATCC35984株則無明顯變化。這些蛋白的功能變化雖然與ATCC35984株生物膜的形成沒有直接相關性，但對其致病力產生了重要的影響。此部分的研究結果提示由于致病環(huán)境的變化，使得ATCC35984株基因組在進化過程中獲得了較多的致病性相關基因，從而具有較強的致病能力，并且這種進化目前仍在繼續(xù)。 第二部分trap基因表達與表皮葡萄球菌生物膜形成及附屬基因調節(jié)(agr)系統(tǒng)活化的相關

8、性 對表皮葡萄球菌ATCC35984株和ATCC12228株對數(shù)生長中期的蛋白進行研究發(fā)現(xiàn)TRAP蛋白(TargetofRNAⅢ-activatingprotein，RNAⅢ活化蛋白的靶蛋白)表達存在差異。在金黃色葡萄球菌中TRAP是一個毒力和生物膜形成的調控因子，并且也是agr系統(tǒng)活化必需的通路蛋白，但在表皮葡萄球菌中尚未見研究報道。 我們采用實時定量PCR對表皮葡萄球菌臨床株(4株生物膜陽性菌株和3株陰性菌株)tra

9、p基因和RNAⅢ(agr系統(tǒng)的效應子)的轉錄水平進行研究，并以SEl457△agr(agr系統(tǒng)突變株)作為陰性對照。結果顯示2株生物膜陽性株trap基因的轉錄降低(與ATCC35984株相比分別降至0.029倍和0.322倍，p＜O.05)，而RNAⅢ轉錄未見降低，并且存在trap基因轉錄下降而RNAⅢ轉錄上升的現(xiàn)象(trap轉錄降至0.322倍，RNAIII轉錄增至4.001倍)。實驗結果提示在表皮葡萄球菌中，trap基因的轉錄和翻譯

10、與生物膜形成及agr系統(tǒng)活化之間不存在一個直接的相關性。對不同生長時期trap基因和RNAⅢ轉錄水平的研究顯示，RNAⅢ的轉錄隨著細菌的增多而逐漸增加(熒光比值從2.83，9.05增至12.30)，在對數(shù)生長晚期達到最高，而trap基因的轉錄在各個時期均較低。對TRAP蛋白的同源性分析顯示其是葡萄球菌的保守性蛋白，但表皮葡萄球菌與金黃色葡萄球菌TRAP蛋白序列之間存在一個氨基酸的移位，從進化樹(phylogenictree)中也可以看出

11、兩個菌種之間存在明顯的進化距離，提示可能是兩者功能差異的原因。 第三部分葡萄球菌雙組分調控系統(tǒng)的生物信息學分析 鑒于雙組分調控系統(tǒng)(Two-componentsystem，TCS)對葡萄球菌重要的調控作用，我們對葡萄球菌的雙組分系統(tǒng)進行了生物信息學分析。在所研究的8株葡萄球菌基因組中(6株金黃色葡萄球菌和2株表皮葡萄球菌)均存在16或17對雙組分系統(tǒng)，這些雙組分系統(tǒng)的G+C含量與基因組相近，在基因組中均勻分布，參與調控多

12、種重要的生物功能。對雙組分系統(tǒng)組氨酸蛋白激酶(histidinekinase，HK)和反應調節(jié)蛋白(responseregulator，RR)的功能域進行分析，得到了4組HK和5組RR。HATPasec功能域和REC功能域分別是葡萄球菌HK和RR的標志，其余HisKA、PAS、HAMP、GAF、KDP、5TM-5TMRLYT和各類DNA結合功能域也存在于葡萄球菌的HK和RR中。對葡萄球菌HK進一步根據(jù)ForstS提出的標準進行分類，發(fā)現(xiàn)

13、可以歸為Ⅰ-Ⅳ類(無CheA類)，Ⅰ類是最主要的一類，與其他革蘭陽性菌的觀察結果相符。在葡萄球菌RR中，3個保守性殘基Asp、Gly和Lys的同源性較高，存在于所有RR中。金黃色葡萄球菌典型雙組分系統(tǒng)與主要毒力因子關系示意圖顯示其可以對多種毒力因子發(fā)揮調控作用，組成了復雜的交互調節(jié)網(wǎng)絡。但是在表皮葡萄球菌中對此研究較少，值得我們進一步探討。 第四部分表皮葡萄球菌srrB/srrA雙組分調控系統(tǒng)的研究 根據(jù)上述對雙組分系統(tǒng)

14、的分析得知在金黃色葡萄球菌中srrB/srrA(staphylococcalrespiratoryresponse)雙組分系統(tǒng)的作用是調節(jié)毒力因子分泌和呼吸代謝，因此我們選擇在表皮葡萄球菌中對srrB/srrA進行研究，希望可以通過序列的分析和缺失突變株的構建而研究其調控網(wǎng)絡以及對細菌表型的影響。 對表皮葡萄球菌1457株srrA和srrB基因的分析顯示其與金黃色葡萄球菌同源性很高，分別為90﹪和69.9﹪。通過基因序列和位黃的

15、比較確定了表皮葡萄球菌srrA基因的TATA盒、RBS(Ribosomebindingsequence，核糖體結合序列)以及srrB基因的RBS。對SRRA和SRRB蛋白的功能域分析發(fā)現(xiàn)兩者均具有雙組分系統(tǒng)典型的功能域。并且在轉錄水平上也檢測到了轉錄活性。但是在構建srrB/srrA缺失突變株卻未獲得成功，所得到23個重組抗性突變株并不是在目的基因srrA和srrB處發(fā)生同源重組。失敗的原因可能是基因組中較多重復序列(repeat)的干