抗DR5多價抗體的抗腫瘤作用.pdf

1、背景：
　　 腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）相關的凋亡誘導配體（TNF-related apoptosisinducing ligand，TRAIL）能夠誘導多種腫瘤細胞和轉化細胞發(fā)生凋亡。TRAIL誘導腫瘤細胞凋亡是通過其受體TRAIL-R1（Death receptor 4，DR4）及TRAIL-R2（Death receptor5，DR5）介導的，但一些研究發(fā)現(xiàn)TRAIL對正常的肝細胞有

2、毒性作用，限制了其在臨床上的應用。一些抗TRAIL死亡受體的單克隆抗體具有死亡受體配體的功能活性，能模擬TRAIL的作用，誘導腫瘤細胞凋亡，而且對正常人的肝細胞等沒有毒副作用。本實驗室利用人DR5蛋白制備出分泌抗DR5抗體的雜交瘤細胞-YM366EC，研究發(fā)現(xiàn)抗DR5抗體交聯(lián)后對腫瘤細胞的增殖有明顯的抑制作用，可以誘導對TRAIL敏感的腫瘤細胞的凋亡。但是，單克隆抗體存在一些缺陷，如完整的抗體分子量大，而且大部分抗體是鼠源性抗體，應用于

3、人體會產生人抗鼠抗體反應（Human anti-mouse antibody，HAMA）等，引起免疫排斥反應，阻斷抗體效用的發(fā)揮，因而妨礙了其在臨床上的應用。隨著DNA重組技術的發(fā)展，可以應用基因工程技術制備基因工程抗體，既能保持單克隆抗體均一性，特異性強的優(yōu)點，又能克服其鼠源性的弊端。多價抗體是基因工程抗體之一，近年來人們對用基因工程技術生產多價抗體已進行了大量的實驗，取得了迅速地發(fā)展。
　　 目的：
　　 通過構建Y

4、M366EC的多價抗體，使得DR5 發(fā)生交聯(lián)，誘導腫瘤細胞凋亡。
　　 方法：
　　 應用兼并PCR、5′-RACE 技術從抗DR5 雜交瘤細胞YM366EC中釣取抗DR5 抗體可變區(qū)基因VL、VH，用連接肽基因（Gly4Ser）3 將VL和VH 連接成單鏈抗體scFv，命名為3D。隨后利用重疊延伸PCR 技術分別將單鏈抗體scFv 與人IgG3上游鉸鏈區(qū)/p53四價功能域融合基因、C4 結合蛋白融合基因連接，得到四價和

5、八價抗體融合基因，分別命名為3S及3B。測序正確后，利用Hind Ⅲ和XhoⅠ酶切位點，將三段融合基因分別克隆入真核表達載體pSecTag2-A中，得到p-3D，p-3S及p-3B，將上述質粒分別轉染CHO 細胞，進行真核表達。利用SDS-PAGE和Western blot 實驗鑒定重組蛋白的表達，表達產物經Ni2+-NTAsuperflow 親和柱純化后，通過MTT 實驗檢測重組抗體對腫瘤細胞增殖的影響，利用流式細胞儀測定其抗腫瘤活性

6、。
　　 結果：
　　 成功克隆了抗DR5 抗體的可變區(qū)VL、VH基因，構建了單鏈、四價、八價真核表達載體；SDS-PAGE和Western blot 實驗證明：p-3D、p-3S及p-3B 質粒表達產物中分別含有約35 KD、40 KD及40 KD大小的特異性蛋白條帶；MTT 實驗結果顯示四價和八價重組抗體對腫瘤細胞的增殖有明顯地抑制作用，流式細胞儀結果顯示：單鏈抗體沒有抗腫瘤活性，四價和八價重組抗體都具有很好的抗腫瘤