煙草NtWRKY4和NtWRKY9的基因功能分析.pdf

1、本論文以傳統(tǒng)植物材料——煙草(NicotianatobacumL.)為實驗材料，運用分子遺傳學和生物技術等研究方法和手段，進行了植物抗逆信號轉導途徑之中兩個關鍵調(diào)控基因的分子生物學功能的研究。 實驗以栽培煙草為研究材料，通過文獻分析，歸納出10個具有WRKY基因家族結構域的基因，經(jīng)過引物設計，分別經(jīng)PCR擴增，獲得200-500bp的基因片斷，并克隆到TA載體，經(jīng)序列分析后，再將這些片斷分別亞克隆到pHANNIBAL載體，構建成

2、ds-RNA表達載體(RNAi方法)。隨后將構建好的ds-RNA基因表達載體亞克隆到帶有35S強啟動子的pOCA30載體，轉入農(nóng)桿菌。通過農(nóng)桿菌介導分別將10個WRKY基因ds-RNA表達載體轉入煙草葉片細胞，經(jīng)抗性愈傷組織篩選和植株再生，并經(jīng)NorthernBlot分子檢測，獲得轉基因株系。然后，比較系統(tǒng)地對轉基因植物T1代植株形態(tài)變化進行了觀察分析，用假單孢菌Pseudomonassyringaepv.tomatostrainDC3

3、000菌株、煙草花葉病毒TMV和爪哇根結線蟲(MeloidogynejavanicaChitwood)侵染以及非生物逆境因子處理，分析轉基因植株的抗病性和抗逆性。 本研究發(fā)現(xiàn)了二個煙草WRKY基因的重要生物學功能。 其中基因WRKY9對線蟲處理有積極響應。采用不同的線蟲濃度、不同的植株數(shù)量、不同的溫度進行處理，結果都是：高抑制NtWRKY9基因的轉基因植株與對照相比，降低了對線蟲的抗病性。線蟲侵染的抗性鑒定項目是：根結百

4、分率、腐爛根百分率、地上部分重和根重。結果表現(xiàn)為：根結出現(xiàn)早，根增粗快，根結多，帶根結的根比例高，根較早衰老，生物量降低等。 分子檢測結果證明該基因主要在根中表達。NtWRKY9轉基因植株受到線蟲感染以后，無論在葉中或在根中，PR1基因增強了表達量。PR2基因則受影響較小，增強幅度小。煙草抗線蟲相關基因Extensin，在線蟲感染前和感染后，轉基因植株與野生型相比，表達量沒有顯著變化。 煙草WRKY4基因對SA和TMV處

5、理響應積極。實驗中NtWRKY4基因能夠被SA誘導，而且被其它非生物逆境因子誘導的表達量低。通過TMV病毒接種，轉基因植株對病毒有清楚的響應，形態(tài)發(fā)生了顯著的變化，花葉更重，葉片變形、扭曲，證明NtWRKY4確實與抗病性有關。感染病原細菌P.S.DC3000細菌也同樣證明了其與抗病性有關。 TMV病毒在野生型植株中的積累相對迅速地增強，并較迅速地減弱，對葉片形態(tài)影響較小，而轉基因植株則因為NtWRKY4受到抑制而積累時間長，抗性

6、降低，形態(tài)受到嚴重影響，造成畸形葉，證明NtWRKY4與調(diào)控抗病毒過程有關。但TMV并不能誘導NtWRKY4的表達，說明在整個抗病信號傳導過程中，NtWRKY4不受TMV的調(diào)控。 轉基因植株中PR基因在TMV誘導時受到抑制，證明NtWRKY4與PR基因表達有正相關關糸。 抑制NtWRKY4基因，造成煙草的抗干旱性受到影響，說明NtWRKY4還參與非生物逆境的調(diào)控過程，是煙草中重要的抗逆性相關基因。 本研究首次證實