I-UdR-殼聚糖納米微粒的研制及其治療兔肝癌的實驗研究.pdf

1、目的
　　1.通過制備高脫乙酰度低分子量殼聚糖（Chitosan，CS），研制得到殼聚糖納米微粒（Chitosan nanoparticles，CS-NP）作為具有肝癌靶向作用的藥物載體，裝載腫瘤內放射治療藥物125I-脫氧尿嘧啶核苷酸（125I-UdR）后成為具有腫瘤靶向性和緩釋性能的125I-UdR-殼聚糖納米微粒（5-[125I]Iodo-2’-Deoxyuridine-Chitosan-Nanoparticles，125I

2、-UdR-CS-NP）。確定最佳工藝條件并鑒定其理化性質、生物相容性和藥物釋放特性，分析125I-UdR-CS-NP在新西蘭兔體內的藥代動力學、組織分布和內照射細胞生物學效應。
　　2.分析驗證125I-UdR-CS-NP對兔肝癌原位模型的被動靶向性，特別是通過肝動脈介入給藥方式所能達到的肝癌靶向能力。
　　3.觀察分析 CS-NP進入腫瘤細胞途徑及其在亞細胞水平的分布、轉運、降解和藥物釋放方式。
　　方法
　　

3、1.采用間歇水解法和輻射降解法制備高脫乙酰度低分子量殼聚糖，并分析其紅外光譜。
　　2.離子交聯(lián)法制備CS-NP，并通過正交試驗優(yōu)化其制備工藝。采用激光粒度分析儀、透射電子顯微鏡和zeta電位儀分析鑒定CS-NP的粒徑、分散度、形態(tài)和表面性狀以及zeta電勢等物理性狀和表征。
　　3.通過MTT法和流式細胞儀檢測肝癌細胞和正常肝組織細胞與CS-NP共同孵育后的存活分數和凋亡率，以評價其生物相容性。
　　4.離子交聯(lián)法制

4、備125I-UdR-CS-NP，并通過單因素分析法確定其最佳工藝條件。測量其粒徑、分散度，并用透射電鏡觀察其形貌。
　　5.采用動態(tài)透析法測量125I-UdR-CS-NP的體外藥物累積釋放率，并繪制累積釋放曲線，觀察比較載藥量與釋藥特性的關系，確認其是否具備長效緩釋特性。
　　6.分析外周靜脈注射125I-UdR-CS-NP后實驗兔的藥代動力學特性和藥物組織分布特征。
　　7.觀察分析實驗兔注射125I-UdR-CS-

5、NP后的血液生化指標和骨髓圖片的變化，評價125I-UdR-CS-NP在生物體內的毒副作用。
　　8.離子交聯(lián)法制備異硫氰酸熒光素標記殼聚糖納米微粒（FITC-CS-NP），并采用激光粒度分析儀、透射電子顯微鏡和zeta電位儀分析鑒定 FITC-CS-NP的粒徑、分散度、形態(tài)和表面性狀以及zeta電勢等物理性狀和表征。
　　9.體外細胞攝取實驗分析肝癌細胞和正常肝組織細胞對125I-UdR-CS-NP的攝取量及其時間效應和劑

6、量效應，以驗證125I-UdR-CS-NP的肝癌靶向性。
　　10.采用激光共聚焦顯微鏡觀察FITC-CS-NP在肝癌細胞和正常肝細胞中不同時段的分布量和位置，驗證CS-NP作為藥物載體的肝癌靶向性。
　　11.采用ROI區(qū)域時間序列掃描技術連續(xù)定量分析FITC-CS-NP進入肝癌細胞和正常肝組織細胞的過程。
　　12.采用MTT法、流式細胞儀觀察肝癌細胞和正常肝細胞經125I-UdR-CS-NP作用后的存活分數和增殖

7、指數。
　　13.用中性單細胞凝膠電泳技術檢測肝癌細胞和正常肝細胞經125I-UdR-CS-NP作用后2h的DNA鏈斷裂程度和作用后24h的DNA損傷修復能力，以評估125I-UdR-CS-NP對腫瘤細胞的殺傷效應。
　　14.超聲引導下采用經皮穿刺術在實驗兔肝左葉種植 VX2瘤塊，制備兔肝癌原位模型，并做病理學鑒定。
　　15.兔肝癌原位模型在 CT引導下采用 Seldinger微導管肝動脈插管術灌注125I-UdR

8、-CS-NP，SPECT分時段觀察125I-UdR-CS-NP在兔體內的分布及其對原位肝癌的靶向性。測量并分析125I-UdR-CS-NP在腫瘤和其他組織中的分布，以驗證其腫瘤靶向性。
　　16.將用藥后48h的腫瘤組織做病理切片后進行Tunel染色，觀察細胞凋亡率改變，以評價125I-UdR-CS-NP的抑瘤效果。
　　17.激光共聚焦顯微鏡觀察37℃和4℃條件下FITC-CS-NP及其原料FITC-CS長鏈分子進入腫瘤細

9、胞的行為特征，以觀察FITC-CS-NP進入細胞的耗能情況。
　　18.采用CPZ、Fil、Amil分別抑制以clathrin-經典途徑、caveolae-途徑和巨胞飲三條納米微粒進入細胞的主要途徑后，定量分析125I-UdR-CS-NP進入肝癌細胞HepG2的量，以分析其內化途徑類型。并用激光共聚焦顯微鏡觀察驗證FITC-CS-NP通過不同途徑進入肝癌細胞的跨膜過程及其在細胞內的分布特征。
　　19.采用多色熒光染色技術觀

10、察FITC-CS-NP在亞細胞水平的動態(tài)分布、轉運和降解的行為特征。
　　結果
　　1.間歇水解法和輻射降解法制備的殼聚糖脫乙酰度為93.062±2.384%，分子量3kDa，外觀為深黃色粉末，在PH=7.0的環(huán)境中可完全溶解，呈深黃色澄清透亮的液體。紅外圖譜表明經堿處理后殼聚糖的酰胺鍵被水解，更多游離氨基暴露，脫乙酰度得到明顯提高。
　　2.成功制備 CS-NP，正交試驗結果表明，對 CS納米微粒粒徑的影響力從大到小

11、依次為 CS分子量>TPP濃度>攪拌速度>CS濃度。優(yōu)化后的制備工藝條件為CS濃度1g/L，攪拌速度600rpm，TPP濃度2g/L，CS分子量3kDa，所制得的CS-NP平均粒徑為70.39±5.12nm，PDI0.16±0.012，zeta電位為+32.5±3.3。透射電鏡觀察其外觀為規(guī)整的球形，表面平整，大小均勻，分散度較好。
　　3. MTT法和流式細胞儀結果都表明 CS-NP對人正常肝細胞株 HL-7702、QSG-77

12、01無細胞毒性；當CS-NP濃度≥200μg/mL時對于人肝癌細胞系HepG2、SMMC-7721有一定的細胞毒性。
　　4.成功制備125I-UdR-CS-NP。優(yōu)化后的制備條件為投藥量1.2～2.4mg/mL， PH5.5，所制得的125I-UdR-CS-NP平均粒徑175.8nm。與空白CS-NP相比，其性狀會略有改變，表現(xiàn)為粒徑增大且均一性下降，結構較疏松，表面形貌略欠規(guī)整。
　　5.125I-UdR-CS-NP在P

13、H5.3到7.4環(huán)境下的釋放曲線符合Higuchi方程，為長效制劑特征，具有明顯的緩釋作用。
　　6.125I-UdR-DLN經外周靜脈用藥后藥代動力學符合二室模型特征，第一時相和第二時相半衰期分別為1.1±0.69 h和1.5±0.16 h，曲線下面積(AUC0-∞)為11.2±1.4mg/L·h。與125I-UdR相比，125I-UdR-CS-NP的生物分布傾向于肝脾，通過腎臟的排泄呈現(xiàn)明顯的延遲現(xiàn)象，骨髓及胃腸道黏膜的藥物分

14、布量較少。
　　7.靜脈注射125I-UdR-CS-DLN劑量高至7.4MBq（6mg），未發(fā)現(xiàn)血液生化指標明顯異常，也無明顯骨髓抑制現(xiàn)象，而125I-UdR對照組2d時骨髓象表明125I-UdR對增殖階段的造血細胞抑制作用較強。表明125I-UdR-CS-DLN明顯減輕了對骨髓造血細胞的抑制作用。
　　8.體外細胞攝取實驗表明125I-UdR-CS-NP對上述2株肝癌細胞具有明顯的靶向性，進入肝癌細胞的量是正常肝細胞的10

15、倍，并具有時間效應和劑量效應。加藥后30min或劑量大于185 kBq/mL時細胞內藥物的放射性強度都會達到飽和。
　　9.成功制備異硫氰酸熒光素標記的 CS-NP（FITC-CS-NP），平均粒徑158.02±12.30nm，zeta電勢為+28.8±3.1。透射電鏡觀察外形呈較為規(guī)整的球形，表面結構較疏松。
　　10.在細胞攝取實驗中，F(xiàn)ITC-CS-NP可被上述2株肝癌細胞可大量攝取，且在細胞漿內呈不均勻分布；而FIT

16、C-CS-NP進入2株正常肝細胞明顯減少，更多的是吸附在細胞膜上，30min后開始解離。
　　11. ROI時序掃描曲線表明FITC-CS-NP與肝癌細胞HepG2接觸后完成了細胞膜吸附-跨膜內化-進入細胞漿的過程，細胞膜吸附 FITC-CS-NP量的峰值時間為15min，胞漿內FITC-CS-NP熒光峰值時間為30min。FITC-CS-NP同樣可以在15min內大量吸附在正常肝細胞 HL-7702表面，但隨后進入細胞的量很少，

17、且過程明顯減慢。
　　12.當濃度≥37kBq/mL時，125I-UdR-CS-NP作用后肝癌細胞的存活率明顯低于正常肝細胞。流式細胞儀分析細胞周期結果表明，125I-UdR-CS-DLN和125I-UdR對增殖期的細胞都有殺傷作用，并造成細胞增殖周期阻滯在 G1期。而125I-UdR-CS-DLN更對DNA合成后進行有絲分裂的G2/M期HepG2細胞也有明顯的殺傷作用。
　　13.不論是肝癌細胞HepG2還是正常肝細胞HL

18、-7702，經125I-UdR-CS-DLN作用后2h的DNA損傷程度都明顯高于同等劑量125I-UdR組。藥物作用24h后各組的彗星實驗結果表明，125I-UdR-CS-DLN組的 DNA損傷修復能力遠低于125I-UdR組。另外，125I-UdR-CS-DLN組中，肝癌細胞株HepG2的DNA損傷后修復能力明顯低于HL-7702。
　　14.成功制備 VX2腫瘤兔肝原位模型，均為肝左葉單發(fā)腫瘤病灶，平均直徑9.2±1.3mm。

19、
　　15. Seldinger微導管經股動脈成功超選擇至肝左動脈，灌注125I-UdR-CS-NP后， SPECT分時段顯像表明125I-UdR-CS-DLN憑借Seldinger微導管的精確定位和肝臟首過效應，可大量聚積在肝臟和瘤體內，2h時肝臟組織中的125I-UdR-CS-DLN已排泄至全身平均水平，而瘤體內依然有明顯的125I-UdR-CS-DLN濃聚，到24h時ROI感興趣區(qū)T/NT比值達4.49±1.22。表明125

20、I-UdR-CS-DLN在兔體內實驗中對肝原位腫瘤有明顯的被動靶向性，且具備緩釋特征。用藥后48h時的藥物組織分布表明瘤內放射性強度超過正常肝組織的12倍，是肌肉組織的50倍左右，且表現(xiàn)出更長的藥物緩釋時間，進一步證明了125I-UdR-CS-DLN在兔活體中對肝原位腫瘤的被動靶向性和緩釋特征。
　　16.介入給藥后48h時腫瘤組織Tunel染色結果表明，125I-UdR-CS-DLN可致腫瘤細胞發(fā)生明顯的凋亡，其腫瘤殺傷能力明顯

21、高于同等劑量的125I-UdR。
　　17.激光共聚焦顯微鏡觀察結果表明，F(xiàn)ITC-CS-NP進入腫瘤細胞主要通過一類溫度依賴的，需要消耗細胞能量的主動攝取機制。
　　18.肝癌細胞攝取125I-UdR-CS-DLN是多種途徑共同參與的，以巨胞飲途徑為主（43%），clathrin-經典途徑其次（34%），caveolae-途徑僅占12%。這三種胞飲機制相互獨立，不存在協(xié)同作用，但存在一定的代償作用。激光共聚焦顯微鏡進一步通

22、過形態(tài)和定量手段驗證了 FITC-CS-NP通過三條胞吞途徑進入肝癌細胞的跨膜過程，并觀察不同胞吞內體在亞細胞水平的分布規(guī)律。
　　19.采用多色熒光染色技術分時段觀察結果表明經 clathrin-經典途徑內吞的FITC-CS-NP跨膜較快，入胞后向細胞核移動并與溶酶體融合，最終次級溶酶體在核周釋放出FITC-CS-NP；經巨胞飲途徑內吞的FITC-CS-NP入胞較慢，跨膜后散在分布于細胞質中，可駐留較長時間，有利于藥物的延遲釋放