大鼠肺微血管內皮細胞β腎上腺素受體胞內運輸及信號轉導的變化與調節(jié).pdf

1、溺海肺損傷包括肺的結構損傷和功能降低。海水淹溺后,引起死亡的主要原因是海水淹溺肺水腫(pulmonary edema of sea water drowning,PE-SWD)。肺微血管內皮細胞(microvascular endothelial cells,MVEC)是位于循環(huán)血液與組織液之間的單層扁平上皮細胞,溺海肺損傷時,肺微血管內皮細胞的結構遭到破壞,使其對液體及溶質的通透性增加,造成滲透性肺水腫。因此降低微血管內皮細胞的滲透性

2、是治療溺海肺損傷的重要環(huán)節(jié)。
　　 Beta-腎上腺素受體(Beta-adrenergic receptorβ-AR)無論是在病理情況下還是生理情況下,對微血管內皮細胞功能和滲透性的調節(jié)都起著十分重要的作用。Β-腎上腺素受體各個亞型,包括β1-AR,β2-AR和β3-AR,在脈管系統(tǒng)均發(fā)揮一定的作用。許多研究證明,受體激動劑激活β2-AR后可在一定程度上減輕有致炎因子所導致的內皮細胞滲透性的增高,但改變程度有限,臨床效果并不理想

3、。有研究表明這可能與β2-AR在細胞膜的表達水平有關,具體機制不明。最近的研究表明Rab1可調節(jié)β-AR在細胞膜上的表達,為臨床藥物干預提供了新的靶點和策略。
　　 β-AR的胞內運輸對發(fā)揮其正常功能是十分重要的。Β-AR在細胞表面上表達的水平是受體內化、循環(huán)和降解三方面平衡調節(jié)的結果。以往的研究也往往集中在受體內化、循環(huán)和降解這三個方面,而受體從內質網到細胞膜的運輸路徑以及這些路徑對受體功能的影響卻知之甚少。
　　 事

4、實上,受體在細胞器間的運輸是受Rab蛋白調節(jié)的。Rab蛋白是Ras超家族的一個成員,目前在人類基因組中已證實的有60多種。幾乎所有的Rab蛋白都參與了細胞中囊泡的形成、對接或融合,也參與了細胞的胞吞和胞吐過程。內皮細胞主要表達Rab1-9,11,13,14,15,18,22和30。Rab1存在于內質網和高爾基體,主要參與蛋白從內質網到高爾基體的順向調節(jié)。目前已經發(fā)現在HEK293T細胞和心肌細胞中,Rab1參于了G蛋白偶聯(lián)受體從內質網向

5、高爾基體運輸的調節(jié),表明Rab1功能的改變可能影響內皮細胞表面β-AR的表達,繼而影響細胞的滲透性。
　　 本實驗試通過轉染野生型Rab1、Rab1突變體及Rab1小片段RNA觀察β-AR在大鼠肺微血管內皮細胞表面的表達和功能,同時探討Rab1對大鼠肺微血管內皮細胞滲透性的影響。
　　 研究內容:
　　 1.采用外周肺組織貼塊法培養(yǎng)大鼠RPMVECs,對培養(yǎng)細胞進行CD34、植物凝集素BSI、Ⅷ因子相關抗原免疫細

6、胞化學染色鑒定,通過光鏡和透射電鏡觀察細胞形態(tài)和超微結構。
　　 2.運用配體飽和測定法測定大鼠RPMVECs海水和LPS處理后、慢病毒包裝的Rab1WT轉染后β-AR在胞膜上的表達。
　　 3.運用熒光顯微鏡檢測慢病毒包裝的Rab1WT、Rab1N124I和Rab1siRNA轉染PMVEC后β-AR在細胞膜和內質網的分布狀況。
　　 4.運用Western Blot檢測慢病毒包裝的Rab1WT和Rab1N124

7、I轉染PMVEC后pERK1/2的表達情況。
　　 5.運用ELISA方法檢測RPMVECs用海水、LPS處理以及轉染Rab1WT后對牛血清白蛋白(BSA)的透過情況。
　　 結果:
　　 1.組織塊法培養(yǎng)大鼠RPMVECs的綜合鑒定結果顯示:組織塊源于外周肺組織,Ⅷ因子相關抗原和CD34免疫熒光化學染色陽性,植物凝集素BSI結合試驗陽性,透射電鏡細胞表面有較多突起,胞漿中有較多吞飲小泡。
　　 2.海水

8、及LPS處理后β-AR在胞膜上的表達明顯降低,轉染Rab1WT后可恢復β-AR在胞膜上的表達。
　　 3.轉染Rab1WT后β-AR主要在胞膜上表達,轉染Rab1N124I和Rab1siRNA后β-AR主要積聚在內質網。
　　 4.轉染Rab1WT后pERK1/2的表達明顯升高,轉染Rab1N124I后Rab1WT后pERK1/2的表達明顯降低。
　　 5.海水及LPS處理后對RPMVECs牛血清白蛋白(BSA)