斑蝥素間接競爭性ELISA檢測方法的建立及眼斑鞠菁體內斑蝥素的免疫熒光檢測.pdf

1、眼斑芫菁(Mylabris Cichorii Linnaeus)，又稱為黃黑小斑蝥，是鞘翅目芫菁科昆蟲，也是傳統的中藥動物藥。現代的臨床學研究發(fā)現，眼斑芫菁在治療癌癥和一些疑難雜癥方面具有獨特效果，其抗癌有效成分就是斑蝥蟲體所含的斑蝥素。到目前為止，對于眼斑芫菁體內的斑蝥素的轉運、分布等方面的研究和相關報道很少，對其生物合成和代謝機制的研究更是有限。
　　 對于斑蝥素的檢測方法，國內外早期是采用重量法和酸堿滴定法。近年來，又發(fā)展

2、出更加精確的氣質聯用法、高效液相色譜法以及反相高效液相色譜法等方法。但是這些方法所需的儀器本身價格比較昂貴，且操作復雜，需要專業(yè)的技術手段，因此只能應用于實驗室的檢測。
　　 酶聯免疫吸附劑測定法因其靈敏度較高、特異性良好、檢測便捷且周期短、成本低廉，廣泛的應用于蛋白類生物大分子的檢測。早期對于缺乏免疫原性的小分子物質，由于不能產生相應的抗體，所以對于小分子物質的檢測主要還是依賴于色譜分析，近年來，研究者將小分子物質與蛋白質大分

3、子結合，合成小分子物質完全抗原的方法，獲得小分子物質的抗體，使得利用免疫學方法檢測小分子物質成為可能。
　　 本研究的目的主要就是建立快速、靈敏的斑蝥素的間接競爭ELISA檢測方法，并對其檢測結果進行評價，為進一步研制斑蝥素檢測試劑盒奠定基礎。同時利用獲得的斑蟊素抗體，以免疫熒光檢測的方法研究斑蝥素在眼斑芫菁成蟲體內的分布，為進一步研究斑蝥素的合成機制以及芫菁科昆蟲體內斑蝥素的代謝途徑等提供有力的支持。研究已經取得如下主要結果：

4、
　　 ①利用已制備的斑蝥素完全抗原，經動物免疫獲得多克隆抗體。經過反復優(yōu)化，建立了斑蝥素的間接競爭性ELISA檢測方法。優(yōu)化后的檢測體系為：用含CA-OVA的PBS(pH7.4)包被液包被酶標板，100μl/孔，4℃孵育過夜。在酶標板中加入封閉液1％明膠(200μl/孔)，置37℃孵育2h。同時加入用pH7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋的斑蝥素標準品和按1:200稀釋的一抗各50μl/孔，37℃下孵育1h，使固定抗原CA-OVA與斑蝥

5、素競爭性地結合一抗。加入HRP酶標記的羊抗兔IgG(用PBS緩沖液1:5000進行倍數稀釋)，100μl/孔，37℃下孵育1h。加入配好的OPD顯色液，100μl/孔，于37℃下遮光孵育15min。加入反應終止液體2M濃硫酸，50μl/孔。最后置于酶標儀中，在492nm波長處讀數。
　　 在此檢測體系下，對斑蝥素的檢測標準曲線方程為y=-13.421x+102.45，R2=0.988，檢測范圍為：0.1μg/ml～24μg/ml

6、。其最低檢測下限為0.01μg/ml，批內和批間變異系數分別為4.27％和4.56％，檢測效果良好。
　　 ②對眼斑芫菁25日齡成蟲經組織解剖，然后進行免疫熒光染色，進而利用熒光顯微鏡對眼斑芫菁雌、雄成蟲性腺各部分、生殖附腺、消化道等主要器官系統中熒光強度進行觀察，并利用IPP6.0檢測數據和DPS分析。結果顯示，在雌蟲體內各器官組織中，生殖系統的平均熒光強度要顯著性的高于腸道系統，而生殖系統內以儲精囊的平均熒光強度為最高。雄蟲

7、體內生殖腺和腸道系統以及精巢之間在平均光密度方面存在顯著性差異，而腸道系統和精巢在平均光密度值方面不存在顯著差異。整個蟲體內的組織器官中，以精巢的平均光密度值為最高。雄蟲的腸道系統在平均光密度值方面顯著的高于雌蟲腸道系統，而在生殖系統的比較中，雄蟲的平均光密度值也要高于雌蟲，但是不存在顯著性差異。由此可以推測，眼斑芫菁成蟲其主要的斑蝥素儲存部位位于生殖系統，同時由雌蟲儲精囊中光密度值的高表達也可以確信，其體內的斑蝥素主要是來自于雄蟲，是