星型膠質(zhì)細(xì)胞在不同接觸狀態(tài)下,CyclinA、CyclinD1與P27表達(dá)研究.pdf

1、接觸抑制現(xiàn)象具有重要的生理意義，其與機(jī)體內(nèi)器官，組織的形態(tài)、大小以及各類細(xì)胞數(shù)量的控制有著密切的關(guān)系。機(jī)體的組織器官生長(zhǎng)到一定程度后會(huì)自然停止生長(zhǎng)，而不是無(wú)限制的長(zhǎng)大；在體外培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)細(xì)胞分裂增殖到一定程度，達(dá)到相互接觸時(shí)，細(xì)胞停止分裂。一般認(rèn)為，接觸抑制是由于細(xì)胞數(shù)量的增加消耗了局部區(qū)域的促分裂因子；另一方面是細(xì)胞接觸時(shí)自身分泌了一些細(xì)胞增殖的抑制因子。2001年Nakatsuji Y等人的研究表明：星形膠質(zhì)細(xì)胞的接觸抑制是通過(guò)介

2、導(dǎo)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，而細(xì)胞密度能夠調(diào)控一系列關(guān)鍵細(xì)胞周期蛋白水平的表達(dá)，可能是通過(guò)控制細(xì)胞周期的進(jìn)程而實(shí)現(xiàn)。我們以星形膠質(zhì)細(xì)胞做為模型細(xì)胞，了解接觸抑制的機(jī)理并探討接觸抑制與細(xì)胞周期調(diào)控間的相互關(guān)系。
　　 細(xì)胞周期調(diào)控是細(xì)胞的基本生理功能，其不僅控制細(xì)胞的分裂增殖，而且決定著細(xì)胞的分化及死亡；同時(shí)，細(xì)胞周期調(diào)控對(duì)于細(xì)胞的許多重要生理功能亦有至關(guān)重要的作用。因此，有理由相信，在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的整個(gè)階段，都有可能在細(xì)胞

3、周期的調(diào)控下逐漸進(jìn)展。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白是一組功能各異、相互聯(lián)系、相互制約的核蛋白，按其對(duì)細(xì)胞周期的作用分為細(xì)胞周期正控蛋白（包括Cyclin、CDK和pRb）和細(xì)胞周期負(fù)控蛋白（CKI家族）。細(xì)胞周期蛋白Cyclin作為一類隨細(xì)胞周期變化而循環(huán)出現(xiàn)和消失的蛋白質(zhì)，它是從酵母到人類等真核生物中有廣泛作用的分子。Cyclin在正常細(xì)胞周期調(diào)控中有重要作用。目前在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了20 多種Cyclin。對(duì)細(xì)胞周期有明確調(diào)控作用的主要是Cy

4、clinA、B、C、D和E，Cyclin分子在進(jìn)化上有高度的保守性，其分子結(jié)構(gòu)上都有一段“Cyclin盒”序列，Cyclin通過(guò)與CDK形成復(fù)合物發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞周期或轉(zhuǎn)錄的功能；CDK含量在細(xì)胞周期的各階段相對(duì)恒定，其活性由于Cyclin的調(diào)節(jié)作用有所變化，CDK 必須與相應(yīng)的Cyclin 結(jié)合，并且在一定部位發(fā)生磷酸化或去磷酸化才能有活性或被滅活，Cyclin 及其相關(guān)分子是目前細(xì)胞周期調(diào)控研究中的熱點(diǎn)。細(xì)胞周期負(fù)控蛋白（CKI 家族）

5、包括P21，P27，P57等，可抑制已知的大多數(shù)Cyclin－CDK復(fù)合物的激酶活性，對(duì)G1期的早期與晚期、S 期等各期都有重要作用，且分布與功能在不同的細(xì)胞各異，是目前的主要研究對(duì)象。
　　 為了了解星形膠質(zhì)細(xì)胞在接觸抑制時(shí)相關(guān)的分子機(jī)制，我們選取三種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinA、CyclinD1和P27 作為標(biāo)志物，觀察它們?cè)谛切文z質(zhì)細(xì)胞增殖和接觸抑制過(guò)程中的表達(dá)情況，探討接觸抑制與細(xì)胞周期調(diào)控間的相互關(guān)系。
　　

6、 本研究在體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件下，檢測(cè)其處于半?yún)R合狀態(tài)時(shí)，以及處于匯合狀態(tài)時(shí)CyclinA、CyclinD1與P27等三種蛋白的表達(dá)情況。將純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，分別在其處于半?yún)R合狀態(tài)與匯合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。一、采用免疫組化染色，將半?yún)R合與匯合的細(xì)胞與上述三種蛋白的抗體反應(yīng)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行定性分析并行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。二、采用RT-PCR技術(shù)，分別于半?yún)R合與匯合時(shí)期檢測(cè)上述三種蛋白mRNA的表達(dá)，將細(xì)胞裂解離心制成RNA樣品，逆

7、轉(zhuǎn)錄成cDNA，產(chǎn)物擴(kuò)增，對(duì)其進(jìn)行跑膠，顯影，并將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。免疫組化結(jié)果顯示：與半?yún)R合時(shí)細(xì)胞相比，星形膠質(zhì)細(xì)胞匯合時(shí)CyclinA表達(dá)顯著下降（p<0.05），CyclinD1表達(dá)顯著下降（p<0.05），而P27表達(dá)顯著升高(p<0.01)；RT-PCR結(jié)果顯示：與半?yún)R合時(shí)細(xì)胞相比，星形膠質(zhì)細(xì)胞在匯合時(shí)CyclinA mRNA表達(dá)顯著下降（p<0.01），CyclinD1 mRNA表達(dá)顯著下降（p<0.05），而P27 mR