PEDF蛋白對(duì)子癇前期發(fā)病影響的研究.pdf

1、背景：妊娠期高血壓疾病是妊娠期特發(fā)的全身性疾病，我國(guó)發(fā)病率9.4％，國(guó)外報(bào)道7％～12％，迄今為止仍然是母嬰發(fā)病率及死亡率較高的主要原因。子癇前期(preeclampsia)是該疾病最常見(jiàn)的類型，流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，子癇前期的發(fā)病率約為5-10％，疾病的病因及發(fā)生發(fā)展過(guò)程還不是十分明確，目前主要認(rèn)為免疫失衡機(jī)制，胎盤(pán)淺著床，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞缺血、胰島素抵抗、鈣平衡失調(diào)等機(jī)制可能具有重要的作用。有研究認(rèn)為，子癇前期患者存在

2、子宮蛻膜血管重鑄障礙，絨毛的數(shù)量減少、絨毛內(nèi)的血管發(fā)育不良及間質(zhì)纖維化等，胎盤(pán)缺血缺氧，引起廣泛的血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，最終導(dǎo)致多器官、多系統(tǒng)功能損害。而正常胎盤(pán)血管床生成依賴于胎盤(pán)內(nèi)血管生成誘導(dǎo)因子與抑制因子的復(fù)雜聯(lián)系。色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)是目前已知最強(qiáng)的血管生成抑制劑，它是一種分子量大小約為50kDa的分泌型糖蛋白。PEDF不僅可以抑制新生血管的形成，還可逆轉(zhuǎn)

3、已經(jīng)形成的血管。而且其抑制血管生成的活性具有明顯的選擇性，它可抑制生成病理性血管，但不影響生理性血管的形成。目前研究發(fā)現(xiàn)，PEDF是一種多功能蛋白，廣泛分布于成人和胎兒多種組織（如眼、腦、肝、脂肪、肌肉、胎盤(pán)、卵巢、子宮內(nèi)膜組織等等），具有營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、抗血管生成、抗血管的通透性、抗氧化、抗腫瘤生成、調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞及胰島素生成等特性。2008年美國(guó)Beth等學(xué)者發(fā)現(xiàn)PEDF在正常妊娠婦女的脈管系統(tǒng)和胎盤(pán)的滋養(yǎng)層高度表達(dá)，很可能就是胎盤(pán)血管形成

4、過(guò)程的靜止因子，對(duì)維持血管的靜止?fàn)顟B(tài)和確保正常血管的完整性具有重要作用。以往的大量研究表明，整個(gè)妊娠時(shí)期母體的胎盤(pán)組織以及血清中都可能有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及其受體(VEGF-R)表達(dá)。VEGF是一種有效的血管生成誘導(dǎo)物，VEGF與其受體結(jié)合后可通過(guò)旁分泌途徑調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增生、遷移與浸潤(rùn)，同時(shí)VEGF可增加血管的通透性，造成大量血漿蛋白外滲，提供了促進(jìn)血管生成所需要的暫時(shí)性基質(zhì)。VEGF還能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中

5、具有抗凋亡作用的Bcl-2的表達(dá)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，可見(jiàn)，VEGF在促進(jìn)血管形成和維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能方面具有重要的作用，VEGF在胚胎著床、胎盤(pán)血管發(fā)育的過(guò)程中也非常關(guān)鍵。正常妊娠早期胎盤(pán)組織以及血清中VEGF水平都處于相對(duì)升高的狀態(tài)，可能一方面因?yàn)槿焉镌缙谧甜B(yǎng)細(xì)胞處于相對(duì)缺氧狀態(tài)，低氧通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，刺激VEGF水平上調(diào)，另一方面，在胎兒及胎盤(pán)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，需要充足血液和血氧供應(yīng),VEGF的表達(dá)增加是為了適應(yīng)妊娠的生理

6、改變。研究認(rèn)為孕早期VEGF水平下降與子癇前期發(fā)病密切相關(guān)，子癇前期患者胎盤(pán)組織中和母體外周血清中VEGF水平明顯下降，可能是子癇前期的發(fā)病因素之一。PEDF能夠通過(guò)作用于Fas/FasL介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，從而抑制血管新生;此外，PEDF還可抑制血管緊張素(Ⅱ)對(duì)VEGF的上調(diào)，可見(jiàn)，PEDF是VEGF天然的負(fù)性調(diào)節(jié)劑。PEDF是否類似于VEGF也參與子癇前期的發(fā)病過(guò)程，目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。正常妊娠時(shí)胚泡著床到

7、子宮內(nèi)膜及子宮肌層的過(guò)程主要由分化完全的滋養(yǎng)細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)的，對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的嚴(yán)密調(diào)控在形成正常的胎盤(pán)形成中非常重要，這一過(guò)程受到許多細(xì)胞因子、粘附分子、激素、氧張力等精確的調(diào)節(jié)，滋養(yǎng)細(xì)胞的功能異常是一系列病理妊娠的重要原因，尤其是胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限及子癇前期，其中子癇前期又被稱為滋養(yǎng)細(xì)胞功能障礙疾病。人早孕絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞是一種具有侵襲和破壞能力的細(xì)胞，類似于腫瘤細(xì)胞，但不具有腫瘤細(xì)胞的成瘤特性和轉(zhuǎn)移能力。研究已表明，滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移、侵襲能力的下降

8、可能是子癇前期形成的一個(gè)重要原因。文獻(xiàn)報(bào)道，PEDF能通過(guò)下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9)的表達(dá)水平，以降低腫瘤細(xì)胞的侵襲性，從而具有抗腫瘤的功效。目前研究也證實(shí)了MMP-9基因的表達(dá)下降，能夠降低滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力，與子癇前期的發(fā)病密切相關(guān)。但PEDF是否能夠通過(guò)類似的作用機(jī)制降低滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力，是否參與子癇前期的發(fā)病過(guò)程，這一切都需進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，我們推測(cè)色素上皮衍生因子(PEDF)很可能在子癇前期發(fā)病中發(fā)揮重要作用，且其對(duì)子癇

9、前期發(fā)病影響的研究，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。故本課題從影響胎盤(pán)血管床生成因素為切入點(diǎn)，研究子癇前期患者胎盤(pán)中PEDF蛋白的表達(dá)情況，及其與胎盤(pán)組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及胎盤(pán)微血管密度的關(guān)系;并進(jìn)一步從滋養(yǎng)細(xì)胞層面上研究PEDF蛋白在體外培養(yǎng)的缺氧的滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn)，及缺氧誘導(dǎo)后滋養(yǎng)細(xì)胞功能的變化;通過(guò)將構(gòu)建的載有PEDF基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到滋養(yǎng)細(xì)胞中，研究PEDF對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞功能的影響，從而探討PEDF對(duì)子癇前期發(fā)病的影響，為進(jìn)一

10、步尋找子癇前期的發(fā)病原因及機(jī)理提供基礎(chǔ)。本研究分為三個(gè)部分：
　　 第一部分：PEDF蛋白在子癇前期與正常妊娠胎盤(pán)組織中的表達(dá)。
　　 目的：探討色素上皮衍生因子(PEDF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在子癇前期患者胎盤(pán)組織的表達(dá)及其與胎盤(pán)血管病變的關(guān)系。
　　 方法：隨機(jī)選取2011年10月至2013年1月南方醫(yī)院住院分娩的子癇前期患者60例（其中子癇前期輕度mPE組30例，子癇前期重度sPE組30例）為研究

11、對(duì)象，同期分娩的健康孕婦40例作為對(duì)照組，用western blot、免疫熒光組織化學(xué)雙重標(biāo)記方法檢測(cè)子癇前期患者和正常妊娠婦女（對(duì)照組）胎盤(pán)組織中PEDF、VEGF的表達(dá)，并通過(guò)免疫熒光方法計(jì)數(shù)胎盤(pán)微血管密度(MVD)，同時(shí)進(jìn)行相關(guān)性分析。采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的多組樣本均數(shù)比較的單因素方差分析(Oneway-Anova)，兩兩比較用LSD(least significant difference)檢驗(yàn)，指標(biāo)間采用雙變量相關(guān)分析中的pe

12、arson相關(guān)分析。
　　 結(jié)果：(1)胎盤(pán)的滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中均表達(dá)PEDF、VEGF，主要表達(dá)于胞質(zhì)及胞膜上，且兩個(gè)因子表達(dá)位置大體相同。(2)子癇前期各組患者胎盤(pán)組織中PEDF陽(yáng)性表達(dá)高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而且sPE組PEDF陽(yáng)性表達(dá)高于mPE組(P＜0.05）;(3)與正常對(duì)照組相比，子癇前期輕度組和子癇前期重度組患者胎盤(pán)組織中VEGF表達(dá)減少，分別為0.0840±0.1006，0.07

13、85±0.0748，0.0767±0.0738，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05），而mPE組與sPE組VEGF表達(dá)無(wú)差異(P＞0.05）;(4)正常對(duì)照組，mPE組，sPE組MVD計(jì)數(shù)依次遞減，分別為136.06±9.07，106.40±8.51，92.65±7.89。子癇前期各組與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05），mPE組與sPE組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;(5)子癇前期各組和正常對(duì)照組胎盤(pán)組織中PEDF表達(dá)與V

14、EGF表達(dá)及MVD計(jì)數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.365，P＜0.05;r=-0.655，P＜0.05)，VEGF表達(dá)與MVD數(shù)值的變化則呈顯著正相關(guān)(r=0.448，P＜0.05)。
　　 結(jié)論：PEDF與VEGF在胎盤(pán)的滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)位置大體相同。PEDF蛋白在子癇前期患者胎盤(pán)組織中表達(dá)升高，而VEGF及MVD表達(dá)下降，后兩者均與PEDF表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這提示PEDF可影響胎盤(pán)血管重鑄，可能參與子癇前期的發(fā)生和發(fā)展過(guò)

15、程。
　　 第二部分：缺氧對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞中PEDF的表達(dá)及細(xì)胞功能的影響。
　　 目的：檢測(cè)低氧濃度體外培養(yǎng)的人早孕絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR-8/SVneo細(xì)胞中PEDF蛋白及其mRNA表達(dá)的差異，并研究缺氧對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞功能的影響，以探求PEDF蛋白對(duì)子癇前期發(fā)病的影響。
　　 方法：低氧濃度體外培養(yǎng)人早孕絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR-8/SVneo細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察缺氧對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的影響，并采用細(xì)胞免疫熒光化學(xué)技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光

16、定量PCR檢測(cè)各組滋養(yǎng)細(xì)胞中PEDF蛋白及mRNA表達(dá)的差異。用Tunnel法測(cè)定細(xì)胞凋亡情況，CKK-8法檢測(cè)各組滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力，Transwell板測(cè)定各組滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力。采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-Samples T Test)，指標(biāo)間采用雙變量相關(guān)分析中的spearman相關(guān)分析。
　　 結(jié)果：(1)在1％低氧濃度環(huán)境下體外培養(yǎng)HTR8/SVneo細(xì)胞的生長(zhǎng)情

17、況:HTR8-SVneo細(xì)胞對(duì)缺氧反應(yīng)敏感，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變，細(xì)胞由多邊形或梭形逐漸向圓形變化，突起變小，甚至部分消失。(2)細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示:PEDF蛋白在各組HTR8-Svneo細(xì)胞均有表達(dá)，其免疫反應(yīng)產(chǎn)物表達(dá)主要定位于胞漿和胞膜中;與常氧組相比，缺氧24小時(shí)滋養(yǎng)細(xì)胞中PEDF蛋白的表達(dá)量無(wú)顯著差異(P＞0.05);但缺氧48小時(shí)后，與常氧組相比，低氧組PEDF蛋白的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且缺氧時(shí)間越

18、長(zhǎng)，PEDF蛋白升高更多(P＜0.05)。(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示:與常氧組相比，低氧組PEDF mRNA表達(dá)水平在缺氧24小時(shí)差異不顯著(P＞0.05)，但缺氧48、72小時(shí)PEDF mRNA表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);缺氧時(shí)間越長(zhǎng)，PEDF mRNA表達(dá)越高(P＜0.05)。以上結(jié)果表明缺氧對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞PEDF蛋白和其mRNA的表達(dá)呈時(shí)間依賴性。(4) Tunnel法測(cè)定滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡:與常氧組相比，低氧組細(xì)胞

19、凋亡數(shù)量在缺氧24、48小時(shí)無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但缺氧72小時(shí)細(xì)胞凋亡增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);(5) CKK-8法檢測(cè)各組滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力:各組滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力無(wú)顯著差異(P＞0.05)。(6) Transwell測(cè)定滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力:顯微鏡下可見(jiàn)各組均有數(shù)量不等的滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)至膜下室，與常氧組相比，1％低氧組滋養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)48、72小時(shí)浸潤(rùn)至膜下室的細(xì)胞減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(7)各組HT

20、R-8/SVneo細(xì)胞中PEDF蛋白表達(dá)、mRNA表達(dá)均與凋亡的滋養(yǎng)細(xì)胞呈顯著正相關(guān)(r=0.772，P＜0.05;r=0.839，P＜0.05)，PEDF蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.876，P＜0.05)。(8)各組HTR-8/SVneo中PEDF蛋白表達(dá)與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.615, P＜0.05)。
　　 結(jié)論：我們結(jié)果提示缺氧環(huán)境能導(dǎo)致HTR8-SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞中PEDF蛋白及mRN

21、A表達(dá)增加，且隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，PEDF表達(dá)呈顯著增多趨勢(shì)。缺氧可誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡，而且明顯抑制HTR8-SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力，并隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)其侵襲能力進(jìn)一步下降。但缺氧對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖影響不大。
　　 第三部分：載有PEDF基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖侵襲能力的影響。
　　 目的：構(gòu)建載有PEDF基因的質(zhì)粒(pcDNA-PEDF)，并將其轉(zhuǎn)染到人早孕絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中，研究PEDF對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡、

22、增殖與侵襲功能的影響。
　　 方法：將構(gòu)建好的載有PEDF基因的質(zhì)粒(pcDNA-PEDF)轉(zhuǎn)染到人早孕絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中，通過(guò)細(xì)胞免疫熒光及實(shí)時(shí)熒光定量PCR，觀察轉(zhuǎn)染后24小時(shí)滋養(yǎng)細(xì)胞中PEDF蛋白及mRNA表達(dá)情況;并用Tunnel法測(cè)定細(xì)胞凋亡，CKK-8法檢測(cè)各組滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力，Transwell板測(cè)定各組滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力。多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，兩兩比較用LSD((1)easts

23、ignificant difference)檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用雙變量的spearman相關(guān)分析.
　　 結(jié)果：(1)與正常對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染PEDF質(zhì)粒24小時(shí)后，HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞中PEDF蛋白及PEDFmRNA表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而陰性對(duì)照組與正常對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05）;(2)與正常對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染PEDF基因質(zhì)粒的滋養(yǎng)細(xì)胞組的細(xì)胞凋亡增多，分別為9.67±1.52、15.67

24、±2.52，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而陰性對(duì)照組與正常對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05）;(3)轉(zhuǎn)染PEDF基因質(zhì)粒后，各組HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖無(wú)顯著差異(P＞0.05);(4)與正常對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染PEDF基因質(zhì)粒的滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)入Transwell膜下室的細(xì)胞數(shù)降低，分別為39.00±4.58、20.33±2.52，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05），而陰性對(duì)照組與正常對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05);(

25、5) PEDF蛋白表達(dá)、mRNA表達(dá)均與凋亡的滋養(yǎng)細(xì)胞呈顯著正相關(guān)(r=0.970，P＜0.05;r=0.745，P＜0.05)，PEDF蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.672，P＜0.05);(6) PEDF蛋白表達(dá)與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.882，P＜0.05)。
　　 結(jié)論：PEDF對(duì)維持正常的人早孕絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞功能非常重要，PEDF表達(dá)增多，可增加滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡，降低滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力，且PE