負性協(xié)同刺激分子B7-H4在肺癌免疫逃逸中的作用及其機制.pdf

1、腫瘤的發(fā)生發(fā)展依賴于其處于的微環(huán)境，其由腫瘤細胞本身、間質(zhì)細胞、微血管、組織液及浸潤細胞，如樹突狀細胞、巨噬細胞等共同組成。作為腫瘤免疫效應(yīng)階段的執(zhí)行場所，腫瘤微環(huán)境內(nèi)存在許多因素參與腫瘤組織與免疫系統(tǒng)的相互作用，包括局部效應(yīng)細胞功能障礙、抑制性免疫調(diào)節(jié)細胞Treg和細胞因子的免疫負調(diào)節(jié)作用、抑制性配體受體反應(yīng)以及腫瘤微環(huán)境中T細胞代謝活性的負調(diào)節(jié)等。研究顯示，作為重要的一組參與免疫逃逸的B7家族負性協(xié)同刺激分子在癌組織中表達是腫瘤微環(huán)

2、境中極為重要的一個特質(zhì)，參與構(gòu)建了腫瘤免疫抑制性功能區(qū)。其中，B7-H4是近年來備受關(guān)注的免疫分子，其通過抑制T細胞的增殖、細胞因子的分泌和細胞周期的進程負性調(diào)控T細胞的免疫應(yīng)答，在腫瘤免疫逃逸過程發(fā)揮著極為重要的作用。本文著重分析了B7-H4分子在腫瘤微環(huán)境中相關(guān)免疫細胞、腫瘤細胞上的表達，探討其調(diào)節(jié)機制和生物學(xué)意義，努力揭示其如何介導(dǎo)肺癌免疫逃逸。
　　 論文第一部分采用免疫組織化學(xué)方法檢測了人肺癌組織中87-H4分子的表達

3、，及其和浸潤腫瘤相關(guān)巨噬細胞、CD8+T細胞的相關(guān)性。結(jié)果顯示，在59例NSCLC組織中，B7-H4分子中高表達27例，比例為45.76％。NSCLC組織中B7-H4分子表達水平與肺癌臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與患者性別、年齡、腫瘤組織類型、腫瘤大小無關(guān)。統(tǒng)計學(xué)分析還顯示，肺癌組織中B7-H4分子的表達水平和CD8+T淋巴細胞浸潤程度呈負相關(guān)和CD68+細胞浸潤程度呈正相關(guān)；在B7-H4分子與CD68分子均高表達的肺癌組織中，發(fā)生淋

4、巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例為78.26%，明顯高于兩分子均低表達的患者(30.4%)。
　　 論文第二部分檢測了肺瘥患者癌組織、外周血循環(huán)中CD68+細胞B7-H4分子的表達，并分析了其臨床意義。結(jié)果顯示，人肺癌組織中浸潤了大量的CD68+細胞，其表面廣泛存在B7-H4分子的表達；肺癌患者外周血CD68+細胞上B7-H4表達率為32.39±4.71%，CD68+B7-H4+細胞占總CD68+細胞比例為20.59±2.46%，明顯高于肺結(jié)核患

5、者和健康志愿者。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，CD68+細胞上B7-H4分子表達水平和CD68+B7-H4+細胞數(shù)量與肺癌患者性別、年齡、腫瘤類型無關(guān)，和腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)。本部分還在小鼠肺癌模型中進一步探討了腫瘤相關(guān)巨噬細胞上B7-H4分子的調(diào)節(jié)因素和生物學(xué)意義。結(jié)果顯示，正常小鼠腹腔來源巨噬細胞微弱表達B7-H4分子，荷瘤小鼠腹腔來源巨噬細胞和荷瘤小鼠腫瘤組織浸潤的巨噬細胞均高表達B7-H4分子，這和此前在肺癌患者外周血的檢測結(jié)果

6、相一致。體外采用IL-10刺激巨噬細胞，B7-H4分子可出現(xiàn)出現(xiàn)上調(diào)性表達。肺癌細胞分泌IL-10，亦可以上調(diào)巨噬纓脆上B7-H4分子的表達，當(dāng)加入中和性IL-10單抗后，肺癌細胞培養(yǎng)上清上調(diào)巨噬細胞表面B7-H4分子表達的作用被部分阻斷。B7-H4信號封閉后，巨噬細胞促進了T細胞IFN-γ的分泌，減少了IL—10的分泌。
　　 論文第三部分在小鼠肺癌模型中探討了肺癌細胞上B7-H4分子的表達及其調(diào)節(jié)因素。結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的L

7、LC細脆中存在B7-H4分子mRNA的表達，但其蛋白質(zhì)水平的表達不位于膜表面，而是在胞內(nèi)。荷瘤小鼠腫瘤組織來源的腫瘤細胞不同程度表達B7-H4分子，其中成瘤1W的小鼠腫瘤組織來源的LLC細胞膜表面B7-H4分子的表達水平顯著低于成瘤2w的小鼠。此外，本部分研究進一步觀察了TAM對肺癌細胞表面B7-H4的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，采用TAM上清培養(yǎng)LLC細胞48h、72h后，LLC細胞膜表面B7-H4分子的表達逐漸上調(diào)。ELISA檢測結(jié)果表明，

8、和正常小鼠腹腔來源巨噬細胞相比，肺癌組織來源的腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAM)分泌高水平的TNF-α和IL-10，但IFN-γ分泌水平低下。為證實腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAM)來源的TNF-α和IL-10參與LLC細胞膜表面B7-H4分子的表達，本實驗采用重組TNF-α、IL-10分別刺激LLC細胞48h、72h小時，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LLC膜表面B7-H4分子表達亦逐漸上調(diào)，而正常巨噬細胞培養(yǎng)上清不能上調(diào)LLC細胞膜表面B7-H4分子表達

9、。JAM法檢測結(jié)果表明LLC細胞上B7-H4分子可拮抗CTL的殺傷作用；ELISA檢測表明，LLC細胞上表達的B7-H4分子抑制CTL分泌INF-γ;凋亡實驗分析顯示，LLC細胞上表達的B7-H4分子介導(dǎo)了T細胞凋亡；腫瘤免疫治療實驗結(jié)果表明,B7-H4單抗治療組小鼠腫痛形成延緩，成瘤時間晚于對照組小鼠。以上結(jié)果提示，TAM來源的TNF-α、IL-10可刺激LLC細胞膜表面B7-H4分子的表達，增加了其腫瘤原性，抑制了T綱胞的功能，介導(dǎo)

10、了免疫逃逸。
　　 論文第四部分探討了腫瘤浸潤樹突狀細胞上B7-H4分子的表達及其生物學(xué)意義。結(jié)果顯示，小鼠骨髓來源的不同分化發(fā)育階段的DCs均有不同程度B7-H4的表達，未成熟DCs表面較高水平表達B7-H4（60.4%±8.9%），在IL-10作用下其表達水平進一步上調(diào)（85.4%±7.5%），未成熟DCs經(jīng)TNF-α刺激48h后，B7-H4的表達水平顯著下調(diào)（30.4%±3.9%）。Westernblot檢測結(jié)果表明，DC

11、經(jīng)TNF-α刺激15min后，ERK1/2分子即出現(xiàn)磷酸化；流式綱胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，imDC在TNF-α、IL-10同時刺激48h后，B7-H4分子表達水平為（35.4%±4.1%），這提示TNF-α可介導(dǎo)DC的成熟，并拮抗IL-10對B7-H4分子的上調(diào)作用。在腫瘤組織，CD11c陽性細胞高表達B7-H4分子(91.4%±5.4%)，相關(guān)細胞因子的檢測結(jié)果表明，腫瘤微環(huán)境中存在大量IL-10、TNF-α，面IFN-γ水平低下。這提示在

12、腫瘤微環(huán)境中TNF-α不能拮抗IL-10對DC上B7-H4分子的上調(diào)作用。MLR結(jié)果顯示，imDC、IL-10-4reatedDCs對T細胞的活化和增殖激發(fā)作用不明顯，當(dāng)加入抗B7-H4阻斷型單抗后，可明顯地促進DCs對T細胞的增殖，這表明阻斷B7-H4分子可增強處于抑制狀態(tài)DCs的免疫刺激活性。相比之下，mDC對T細胞的促增殖作用明顯，加入抗B7-H4阻斷型單抗亦畿增加mDCs對T細胞的促增殖作用，但作用較弱。收集IL-10=trea