球孢白僵菌原生質體遺傳轉化研究及其殺蟲相關基因的分離.pdf

1、遺傳轉化技術不僅是基礎研究的重要手段，而且是利用基因工程改良物種特性的有力工具。目前有關球孢白僵菌遺傳轉化體系的研究較少。本文針對分離自吉林公主嶺當?shù)鼗疾∮衩酌x體的野生型球孢白僵菌為研究對象，從產(chǎn)孢培養(yǎng)基篩選、遺傳轉化顯性標記篩選、原生質體制備、原生質體遺傳轉化等方面對球孢白僵菌的遺傳轉化體系進行探索，為利用基因工程改良球孢白僵菌奠定了堅實基礎。研究結果表明：(1)菌絲生產(chǎn)最適培養(yǎng)基為L-broth液體培養(yǎng)基；(2)產(chǎn)孢最適培養(yǎng)基為P

2、DA培養(yǎng)基；(3)菌齡24h的菌絲體生產(chǎn)的原生質體產(chǎn)量最高，是2.25×1010個/g；(4)用0.01mol/L的β-巰基乙醇在30℃預處理菌絲體20m，原生質體純度達到99﹪以上，原生質體產(chǎn)量和再生恢復率較高；(5)真菌溶壁酶的最適消化濃度是6.0mg/ml，作用時間是1.5小時；(6)0.7mol/LNaCl為原生質體制備的最佳滲透壓穩(wěn)定劑；(7)0.7mol/L葡萄糖為原生質體再生恢復的最佳滲透壓穩(wěn)定劑；(8)L-broth軟瓊

3、脂培養(yǎng)基(0.75﹪的瓊脂粉)上再生恢復率最高，最高可達到57﹪；(9)球孢白僵菌原生質體萌發(fā)可以被25mg/L除草劑完全抑制，孢子和菌絲體萌發(fā)可以被150mg/L除草劑完全抑制，草丁膦類除草劑(phosphinothricin，PPT)可以作為球孢白僵菌遺傳轉化時的選擇壓，除草劑抗性基因bar可以作為選擇標記基因；(10)通過原生質體遺傳轉化方法，將含有bar基因的質粒PTF102轉化到球孢白僵菌，通過連續(xù)5代繼代篩選，獲得PCR鑒定

4、陽性菌落。 穿透體壁是球孢白僵菌感染寄主過程中的重要步驟之一。昆蟲體壁主要由蛋白質和幾丁質組成，球孢白僵菌主要通過機械壓力和蛋白酶、幾丁質酶等水解酶的作用降解昆蟲體壁，因此，克隆編碼這些酶的基因對闡明球孢白僵菌的致病分子機理具有重要意義。本文根據(jù)已報道的病原真菌幾丁質酶、體壁蛋白水解酶、親環(huán)素蛋白基因合成保守引物，從玉米螟蟲生真菌球孢白僵菌中分別分離到幾丁質酶基因、體壁蛋白水解酶和親環(huán)素蛋白基因，生物信息學分析顯示：(1)幾丁質

5、酶基因片段大小為1047bp，編碼了348個氨基酸，與來源于小菜蛾蟲生真菌球孢白僵菌和哈茨木霉的幾丁質酶蛋白序列同源性分別為99﹪和82﹪；(2)體壁蛋白水解酶基因片段長度為1760bp，包含有3個內含子區(qū)段，分別位于331～405，586～646，1157～1223bp的位置，該基因編碼了一個由377個氨基酸組成的蛋白，與蛋白數(shù)據(jù)庫中同源蛋白(AAL5578.1，AAK70804.1)的最高同源性分別為98.9﹪和98.7﹪；(3)親