非轉(zhuǎn)染人角膜上皮細(xì)胞系的建立、鑒定及其克隆化研究.pdf

1、角膜盲是常見的致盲眼病，在我國(guó)有超過(guò)400萬(wàn)患者亟待治療。其中許多患者是由于人角膜上皮(Human Corneal Epithelium，HCEP)發(fā)生不可逆病變而致盲。盡管可以通過(guò)捐獻(xiàn)角膜移植來(lái)治愈，但限于捐獻(xiàn)角膜數(shù)量的嚴(yán)重不足，致使絕大多數(shù)患者無(wú)法重見光明。組織工程人角膜上皮(Tissue-engineered Human Corneal Epithelium，TE-HCEP)作為HCEP的等效替代物，是解決供體角膜不足、絕大多數(shù)H

2、CEP異?；颊邿o(wú)法復(fù)明問(wèn)題的有效途徑。TE-HCEP體外重建的關(guān)鍵要素包括結(jié)構(gòu)功能正常的HCEP種子細(xì)胞的獲得和具有理想生物相容性的載體支架的制備。其中如何獲得大量的符合用于TE-HCEP體外重建要求的種子細(xì)胞成為研究的熱點(diǎn)之一。連續(xù)性人角膜上皮細(xì)胞系能夠提供大量人角膜上皮細(xì)胞(Human Corneal Epithelial Cells，HCEPC)，被認(rèn)為是種子細(xì)胞的理想來(lái)源，目前已經(jīng)建立的HCEPC細(xì)胞系均為癌基因轉(zhuǎn)染的永生化細(xì)胞

3、系，因其潛在致瘤性，無(wú)法應(yīng)用于臨床移植。用非轉(zhuǎn)染方法建立HCEPC細(xì)胞系能為TE-HCEP體外重建提供足量的正常細(xì)胞，但仍未見HCEPC未經(jīng)轉(zhuǎn)染而建立細(xì)胞系的報(bào)道。為了解決TE-HCEP及全層角膜體外重建所需大量HCEP種子細(xì)胞的來(lái)源問(wèn)題，本文利用非轉(zhuǎn)染方法建立HCEPC細(xì)胞系，進(jìn)而從此細(xì)胞系通過(guò)克隆化培養(yǎng)篩選出形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能蛋白表達(dá)正常的單克隆細(xì)胞株，旨在為TE-HCEP及全層角膜的體外重建創(chuàng)造條件。
　　 為了建立非轉(zhuǎn)染HC

4、EPC細(xì)胞系，本文根據(jù)人角膜組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，用0.25％胰蛋白酶液對(duì)撕下的人角膜上皮層進(jìn)行酶解后，再將上皮面朝下直接貼于0.01％明膠處理的24孔板中，12 h后補(bǔ)加含bFGF、EGF、硫酸軟骨素、羧甲基殼多糖和Ⅳ型膠原的DMEM/F12完全培養(yǎng)液(20％胎牛血清)，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，啟動(dòng)HCEPC的原代培養(yǎng)。在上述培養(yǎng)條件下，原代啟動(dòng)3 d后即有細(xì)胞遷出，22 d即可長(zhǎng)成細(xì)胞單層，細(xì)胞為典型的上皮樣細(xì)胞形態(tài)，且生長(zhǎng)分

5、裂旺盛，能穩(wěn)定傳代，凍存后再?gòu)?fù)蘇的細(xì)胞依然可以維持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)和增殖能力。經(jīng)過(guò)連續(xù)的繼代培養(yǎng)(已超過(guò)60代)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀況依然良好，完成了非轉(zhuǎn)染HCEPC細(xì)胞系的建立。
　　 對(duì)連續(xù)傳代HCEPC進(jìn)行細(xì)胞屬性鑒定是確定所建立細(xì)胞系確為HCEPC細(xì)胞系的關(guān)鍵。本文對(duì)已建立的非轉(zhuǎn)染HCEPC細(xì)胞系第90代細(xì)胞進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察、生長(zhǎng)特性檢測(cè)、染色體分析、細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)和致瘤性實(shí)驗(yàn)等鑒定。對(duì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)鑒定，包括光鏡和掃描電鏡觀察，

6、結(jié)果顯示該細(xì)胞系細(xì)胞具備典型上皮樣細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞表面富含微絨毛和偽足。生長(zhǎng)特性分析結(jié)果顯示，該細(xì)胞系細(xì)胞群體倍增時(shí)間為40.56 h，細(xì)胞分裂以及代謝旺盛。染色體組型分析結(jié)果顯示，該細(xì)胞系細(xì)胞特征性染色體數(shù)目為2n=46，并且具備人染色體核型特征，其中出現(xiàn)了染色體數(shù)目的非整倍性。對(duì)HCEP特異性標(biāo)志蛋白免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，該細(xì)胞系細(xì)胞具有細(xì)胞角蛋白K3、K12和K19的陽(yáng)性表達(dá)，結(jié)合染色體組型分析結(jié)果，可以初步確定本文所建立的非轉(zhuǎn)染細(xì)

7、胞系確為HCEPC細(xì)胞系。致瘤性檢測(cè)結(jié)果顯示，該細(xì)胞系細(xì)胞無(wú)任何致瘤性。由此可見，本文建立的細(xì)胞系是非轉(zhuǎn)染、無(wú)致瘤性的HCEPC細(xì)胞系。
　　 為了篩選出染色體數(shù)目正常的HCEPC以用HCEP種子細(xì)胞，本文利用已建立的非轉(zhuǎn)染HCEPC細(xì)胞系進(jìn)行了克隆化研究。采用有限稀釋法，以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為飼養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)HCEPC細(xì)胞系細(xì)胞進(jìn)行克隆化擴(kuò)增，挑選出單克隆細(xì)胞株進(jìn)行染色體組型分析，篩選一株具有2n=46正常核型的單克隆細(xì)胞株，命名為

8、HCEP-5A1單克隆細(xì)胞株。該單克隆細(xì)胞株細(xì)胞經(jīng)凍存然后復(fù)蘇后其生長(zhǎng)狀態(tài)保持良好。通過(guò)免疫熒光檢測(cè)該單克隆細(xì)胞株細(xì)胞的HCEP標(biāo)志蛋白、連接蛋白和功能蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示其具有K3和K12的陽(yáng)性表達(dá)，證明其HCEPC屬性；具有間隙連接蛋白-43和整聯(lián)蛋白β1的陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明其具備形成細(xì)胞通訊連接和錨定連接的潛能，可形成完整的人角膜上皮層；具有鈣泵PMCA1/4蛋白和14-3-3s蛋白的陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明其具備發(fā)揮正常HCEPC的跨膜運(yùn)