vMIP-Ⅱ在大腸桿菌表達(dá)、純化的條件優(yōu)化及活性鑒定.pdf

1、　　目的：本研究主要對(duì)病毒基因來(lái)源的人趨化因子同源物vMIP-Ⅱ在原核細(xì)胞的表達(dá)及純化條件進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)其活性進(jìn)行鑒定,為大量獲取單鏈vMIP-Ⅱ和將其用于趨化因子受體封閉因子的臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)對(duì)已克隆轉(zhuǎn)化的菌株進(jìn)行誘導(dǎo),并用Amylose resin親和純化目的蛋白,再經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析純化結(jié)果,以Transwell趨化小室和FN包被的96孔板對(duì)vMIP-Ⅱ的生物學(xué)活性進(jìn)行鑒定。

2、用MTT法檢測(cè)vMIP-Ⅱ?qū)ν庵苎獑蝹€(gè)核細(xì)胞的毒性及對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果：vMIP-Ⅱ/MBP融合蛋白在大腸桿菌中呈高效分泌型表達(dá),SDS-PAEG可見(jiàn)在54KD位置有一明顯的誘導(dǎo)表達(dá)條帶。最佳誘導(dǎo)條件為：TB培養(yǎng)基、0.3mmol/L IPTG、28℃誘導(dǎo)4h。免疫印記結(jié)果顯示在54KD位置有一明顯的藍(lán)染條帶。該菌的最佳純化條件為：30%的P2緩沖液,MgSO4用量為50ml/g濕菌,濃度為5mmol/L。該法獲得的融合

3、蛋白酶切后得到的單體活性較高,對(duì)PBMC趨化、黏附特性的抑制率達(dá)50%以上。vMIP-Ⅱ的細(xì)胞毒性較低,對(duì)PHA刺激的淋巴細(xì)胞的增殖性應(yīng)答沒(méi)有抑制作用。
　　結(jié)論：1.溫度及培養(yǎng)基類型影響vMIP-Ⅱ/pMAL轉(zhuǎn)化菌在大腸桿菌中的表達(dá)效果。IPTG濃度對(duì)該菌誘導(dǎo)表達(dá)量無(wú)明顯影響。
　　2.由于MBP標(biāo)記蛋白C端融合,Western blot檢測(cè)到MBP抗原性,說(shuō)明該載體成功誘導(dǎo)表達(dá)MBP融合蛋白,沒(méi)有出現(xiàn)錯(cuò)誤的轉(zhuǎn)錄終止。