生長獺兔毛囊發(fā)育規(guī)律及蛋氨酸調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、獺兔是著名的皮用兔，兼顧產(chǎn)肉。獺兔的養(yǎng)殖已經(jīng)成為我國養(yǎng)殖業(yè)的一個(gè)新熱點(diǎn)，其被毛具有“短、平、密、細(xì)、美、牢“的特點(diǎn)，在獺兔養(yǎng)殖中，獺兔的毛皮品質(zhì)有著重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。評(píng)定獺兔毛皮品質(zhì)的主要指標(biāo)有被毛密度、被毛長度、粗毛率、絨毛細(xì)度和皮張面積等，其中被毛密度和皮張面積最重要。近年來，如何提高獺兔毛皮品質(zhì)已經(jīng)成為獺兔生產(chǎn)中最重要的關(guān)注點(diǎn)。山羊、水貂等動(dòng)物皮膚和毛囊的研究結(jié)果表明，毛囊結(jié)構(gòu)與其產(chǎn)毛量和毛皮質(zhì)量有密切關(guān)系。作為一個(gè)比較新型的養(yǎng)殖物

2、種，獺兔被毛密度與毛囊發(fā)育研究在國內(nèi)外報(bào)道較少。本研究即以獺兔毛囊發(fā)育規(guī)律為基礎(chǔ)，采用動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)、離體組織器官培養(yǎng)和分子生物學(xué)相結(jié)合，從活體和組織器官兩個(gè)方面研究Wnt10b在生長獺兔毛囊周期中的變化，對(duì)毛囊發(fā)育的影響以及營養(yǎng)素蛋氨酸調(diào)控獺兔毛囊發(fā)育的作用機(jī)制，以期為營養(yǎng)調(diào)控獺兔被毛品質(zhì)提供技術(shù)支撐，為提高獺兔毛皮品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。
　　1．出生～8周齡獺兔毛囊發(fā)育規(guī)律的研究
　　本研究以出生～8周齡獺兔背部皮膚為研究對(duì)象

3、，通過組織學(xué)觀察皮膚毛囊發(fā)育情況。橫切皮膚發(fā)現(xiàn)出生0周齡時(shí)背部毛囊主要為初級(jí)毛囊，初級(jí)毛囊周圍分布次級(jí)毛囊數(shù)量較少；2周齡時(shí)次級(jí)毛囊數(shù)量開始增多，初級(jí)毛囊周圍次級(jí)毛囊數(shù)量基本達(dá)到2～3個(gè)；4周齡時(shí)次級(jí)毛囊未見明顯增多，但初級(jí)毛囊直徑變大明顯；6周齡和8周齡時(shí)初級(jí)毛囊周圍次級(jí)毛囊分化明顯增多?？v切皮膚發(fā)現(xiàn)0周齡時(shí)毛囊主要處于生長期；2周齡時(shí)有生長期和退化期毛囊共存；4周齡時(shí)有生長期、退化期和靜止期三種毛囊形態(tài)共存，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了毛囊變大的變化

4、；6周齡和8周齡時(shí)大多數(shù)毛囊又處于生長期。對(duì)皮膚表皮層和真皮層厚度統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，0～8周齡背部皮膚表皮層和真皮層厚度變化明顯（P＜0.05），表皮層厚度呈先降低后升高的變化，在4周齡和6周齡時(shí)厚度最??；真皮層厚度變化呈先升高后降低再升高的變化，0周齡和4周齡時(shí)厚度達(dá)到最小，8周齡時(shí)厚度最大。表明獺兔毛囊發(fā)育存在周期性。
　　2．出生～8周齡獺兔毛囊發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)規(guī)律的研究
　　對(duì)出生~8周齡獺兔毛囊發(fā)育相關(guān)基因IGF-I、IG

5、F-IR、EGF、BMP2、FGF-5、Kap3.1、Kap6.1、GHR、TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3表達(dá)規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)，出生0周齡時(shí)各基因均存在一定的表達(dá)，說明獺兔的毛囊發(fā)育在胚胎時(shí)期已經(jīng)開始進(jìn)行。IGF-I、EGF、TGFβ-2、TGFβ-3的mRNA表達(dá)水平均在2周齡時(shí)顯著低于出生時(shí)（0周齡）（P＜0.05），之后表達(dá)水平呈逐漸增高；IGF-IRmRNA表達(dá)水平呈先降低后升高的變化，在2周齡和6周齡時(shí)顯著低于出生0周齡

6、和8周齡（P＜0.05）；TGFβ-1基因表達(dá)水平在2、4周齡時(shí)表達(dá)顯著高于6、8周齡并在2周齡時(shí)表達(dá)達(dá)到最高（P＜0.05）；Kap3.1的基因mRNA表達(dá)水平在2周齡時(shí)顯著高于出生后，然后進(jìn)入緩慢上升的平臺(tái)期，并在8周齡時(shí)顯著升高（P＜0.05）。Kap6.1 mRNA表達(dá)水平在4周齡時(shí)達(dá)到最低，之后表達(dá)水平逐漸升高并在8周齡時(shí)達(dá)到最大值（P＜0.05）；GHR（P＜0.05）、FGF-5（P＜0.05)和BMP2(P＜0.05)m

7、RNA表達(dá)水平呈先出先升高后降低再升高。
　　3．Wnt10b在獺兔毛囊周期中的表達(dá)觀察
　　試驗(yàn)對(duì)出生～8周齡獺兔背皮中Wnt10b及經(jīng)典Wnt通路中β-catenin和跨膜受體蛋白Dsh表達(dá)規(guī)律進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，出生～8周齡背部皮膚中Wnt10b mRNA表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)，β-catenin基因表達(dá)變化差異明顯（P＜0.05）。但對(duì)Wnt10b、β-catenin和Dsh在背部皮膚中的蛋白表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，Wnt1

8、0b（P＜0.05）、β-catenin（P＜0.05）和Dsh（P＜0.05）的蛋白表達(dá)在2周齡和4周齡時(shí)表達(dá)量達(dá)到最低。Wnt10b和β-catenin的mRNA和蛋白表達(dá)不一致，推測(cè)與該時(shí)期翻譯后蛋白質(zhì)的合成加工有關(guān)。免疫組化定位Wnt10b在毛囊的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Wnt10b特異性的表達(dá)于獺兔生長期的毛母質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)在內(nèi)外根鞘也有表達(dá)。在退化期主要表達(dá)于內(nèi)外根鞘，在靜止期獺兔毛囊中少見Wnt10b的表達(dá)。結(jié)果表明Wnt10b可能參與了

9、獺兔毛囊的發(fā)育調(diào)控，并推測(cè)其調(diào)控作用途徑為經(jīng)典Wnt通路。
　　4．Wnt10b在獺兔毛囊周期中的作用及作用的信號(hào)通路研究
　　進(jìn)一步研究Wnt10b在獺兔毛囊發(fā)育中的作用，我們采用建立獺兔游離觸須毛囊培養(yǎng)模型和在體注射模型，從組織器官和活體兩方面研究Wnt10b在獺兔毛囊周期變化中的作用。結(jié)果表明，Wnt10b腺病毒處理組的觸須毛囊毛干生長速度顯著快于對(duì)照組（P＜0.05）。在體注射模型皮內(nèi)注射Wnt10b腺病毒后，處理組

10、的注射部位毛發(fā)生長明顯快于未注射部位。表明Wnt10b對(duì)毛囊的生長有誘導(dǎo)促進(jìn)作用。
　　XAV-939能特異性的抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，在游離觸須毛囊基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入XAV-939處理，發(fā)現(xiàn)處理組毛囊毛干生長速度顯著慢于對(duì)照組，毛干生長速度受到明顯抑制（P＜0.05）。在體注射模型皮內(nèi)注射XAV-939后，處理組的注射部位毛發(fā)生長變慢。因此推測(cè)Wnt10b對(duì)毛囊的促進(jìn)作用是通過Wnt經(jīng)典通路來實(shí)現(xiàn)的。
　　5．Met對(duì)獺兔毛

11、囊發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　選取30日齡斷奶獺兔200只，體重相近，隨機(jī)分為4組，飼喂0、0.30％、0.60%、0.90%Met添加水平的日糧。結(jié)果表明，不同Met水平、不同飼喂天數(shù)對(duì)IGF-I、IGF-IR、EGF、BMP2、FGF-5、Kap3.1、Kap6.1、GHR、TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3等毛囊發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)量影響不同。
　　高M(jìn)et添加水平能降低飼喂40d時(shí)獺兔背皮中的 BMP2基因表達(dá)水

12、平；對(duì)KAPs基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Kap3.1基因表達(dá)僅在飼喂60d時(shí)有顯著變化，0.60%Met添加組Kap3.1表達(dá)量達(dá)到最高（P＜0.05），而Kap6.1基因表達(dá)在不同的時(shí)間點(diǎn)變化與Kap3.1并不相同。對(duì)背皮中EGF基因表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同Met添加日糧飼喂60d時(shí)基因表達(dá)量有顯著變化，0.30%和0.60%Met添加組EGF基因表達(dá)水平顯著高于其他兩組（P＜0.05）。
　　對(duì)TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3基

13、因表達(dá)水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)腗et添加水平能降低獺兔背皮中TGFβ-1和TGFβ-3的基因表達(dá)水平。對(duì)GHR，IGF-Ⅰ,IGF-ⅠR基因表達(dá)規(guī)律分析發(fā)現(xiàn)，日糧Met對(duì)不同飼喂天數(shù)獺兔背皮中的GHR，IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因表達(dá)影響并未呈明顯的一致性變化。
　　6.Met對(duì)獺兔毛囊發(fā)育的影響及Wnt10b參與Met調(diào)控毛囊發(fā)育的機(jī)制初探
　　試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，日糧不同 Met水平飼喂斷奶獺兔60d后，0.30%、0.60%和0.9

14、0%Met添加組的毛囊密度顯著高于對(duì)照組毛囊密度，并且毛囊密度在0.60%添加水平時(shí)達(dá)到最高（P＜0.05）。在體外培養(yǎng)的游離獺兔觸須毛囊中加入Met，發(fā)現(xiàn)30mM、60 mM、90 mM、120 mM、處理組的毛囊生長速度顯著高于對(duì)照組和150 mM、Met添加組（P＜0.05），說明適當(dāng)濃度的Met對(duì)毛囊的生長發(fā)育起到促進(jìn)作用。
　　對(duì)日糧不同Met水平飼喂獺兔背皮中Wnt10b、β-catenin總蛋白、磷酸化β-caten

15、in蛋白和 Dsh蛋白進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著不同 Met水平日糧飼喂斷奶獺兔時(shí)間的增加，獺兔背皮中Wnt10b、β-catenin總蛋白、磷酸化β-catenin以及Frizzled家族跨膜受體蛋白Dishevelled（Dsh）蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)一定的規(guī)律性：適量的 Met添加能提高Wnt10b及其相關(guān)通路蛋白的表達(dá)。這提示，Met對(duì)獺兔毛囊的促生長作用可能是通過調(diào)控 Wnt經(jīng)典即Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。
　　結(jié)論：