生長獺兔毛囊發(fā)育規(guī)律及蛋氨酸調(diào)控機制研究.pdf

1、獺兔是著名的皮用兔，兼顧產(chǎn)肉。獺兔的養(yǎng)殖已經(jīng)成為我國養(yǎng)殖業(yè)的一個新熱點，其被毛具有“短、平、密、細、美、牢“的特點，在獺兔養(yǎng)殖中，獺兔的毛皮品質有著重要的經(jīng)濟價值。評定獺兔毛皮品質的主要指標有被毛密度、被毛長度、粗毛率、絨毛細度和皮張面積等，其中被毛密度和皮張面積最重要。近年來，如何提高獺兔毛皮品質已經(jīng)成為獺兔生產(chǎn)中最重要的關注點。山羊、水貂等動物皮膚和毛囊的研究結果表明，毛囊結構與其產(chǎn)毛量和毛皮質量有密切關系。作為一個比較新型的養(yǎng)殖物

2、種，獺兔被毛密度與毛囊發(fā)育研究在國內(nèi)外報道較少。本研究即以獺兔毛囊發(fā)育規(guī)律為基礎，采用動物飼養(yǎng)試驗、離體組織器官培養(yǎng)和分子生物學相結合，從活體和組織器官兩個方面研究Wnt10b在生長獺兔毛囊周期中的變化，對毛囊發(fā)育的影響以及營養(yǎng)素蛋氨酸調(diào)控獺兔毛囊發(fā)育的作用機制，以期為營養(yǎng)調(diào)控獺兔被毛品質提供技術支撐，為提高獺兔毛皮品質提供科學依據(jù)。
　　1．出生～8周齡獺兔毛囊發(fā)育規(guī)律的研究
　　本研究以出生～8周齡獺兔背部皮膚為研究對象

3、，通過組織學觀察皮膚毛囊發(fā)育情況。橫切皮膚發(fā)現(xiàn)出生0周齡時背部毛囊主要為初級毛囊，初級毛囊周圍分布次級毛囊數(shù)量較少；2周齡時次級毛囊數(shù)量開始增多，初級毛囊周圍次級毛囊數(shù)量基本達到2～3個；4周齡時次級毛囊未見明顯增多，但初級毛囊直徑變大明顯；6周齡和8周齡時初級毛囊周圍次級毛囊分化明顯增多?？v切皮膚發(fā)現(xiàn)0周齡時毛囊主要處于生長期；2周齡時有生長期和退化期毛囊共存；4周齡時有生長期、退化期和靜止期三種毛囊形態(tài)共存，同時發(fā)現(xiàn)了毛囊變大的變化

4、；6周齡和8周齡時大多數(shù)毛囊又處于生長期。對皮膚表皮層和真皮層厚度統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，0～8周齡背部皮膚表皮層和真皮層厚度變化明顯（P＜0.05），表皮層厚度呈先降低后升高的變化，在4周齡和6周齡時厚度最小；真皮層厚度變化呈先升高后降低再升高的變化，0周齡和4周齡時厚度達到最小，8周齡時厚度最大。表明獺兔毛囊發(fā)育存在周期性。
　　2．出生～8周齡獺兔毛囊發(fā)育相關基因表達規(guī)律的研究
　　對出生~8周齡獺兔毛囊發(fā)育相關基因IGF-I、IG

5、F-IR、EGF、BMP2、FGF-5、Kap3.1、Kap6.1、GHR、TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3表達規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)，出生0周齡時各基因均存在一定的表達，說明獺兔的毛囊發(fā)育在胚胎時期已經(jīng)開始進行。IGF-I、EGF、TGFβ-2、TGFβ-3的mRNA表達水平均在2周齡時顯著低于出生時（0周齡）（P＜0.05），之后表達水平呈逐漸增高；IGF-IRmRNA表達水平呈先降低后升高的變化，在2周齡和6周齡時顯著低于出生0周齡

6、和8周齡（P＜0.05）；TGFβ-1基因表達水平在2、4周齡時表達顯著高于6、8周齡并在2周齡時表達達到最高（P＜0.05）；Kap3.1的基因mRNA表達水平在2周齡時顯著高于出生后，然后進入緩慢上升的平臺期，并在8周齡時顯著升高（P＜0.05）。Kap6.1 mRNA表達水平在4周齡時達到最低，之后表達水平逐漸升高并在8周齡時達到最大值（P＜0.05）；GHR（P＜0.05）、FGF-5（P＜0.05)和BMP2(P＜0.05)m

7、RNA表達水平呈先出先升高后降低再升高。
　　3．Wnt10b在獺兔毛囊周期中的表達觀察
　　試驗對出生～8周齡獺兔背皮中Wnt10b及經(jīng)典Wnt通路中β-catenin和跨膜受體蛋白Dsh表達規(guī)律進行分析發(fā)現(xiàn)，出生～8周齡背部皮膚中Wnt10b mRNA表達無顯著差異(P＞0.05)，β-catenin基因表達變化差異明顯（P＜0.05）。但對Wnt10b、β-catenin和Dsh在背部皮膚中的蛋白表達分析發(fā)現(xiàn)，Wnt1

8、0b（P＜0.05）、β-catenin（P＜0.05）和Dsh（P＜0.05）的蛋白表達在2周齡和4周齡時表達量達到最低。Wnt10b和β-catenin的mRNA和蛋白表達不一致，推測與該時期翻譯后蛋白質的合成加工有關。免疫組化定位Wnt10b在毛囊的表達，發(fā)現(xiàn)Wnt10b特異性的表達于獺兔生長期的毛母質細胞，同時在內(nèi)外根鞘也有表達。在退化期主要表達于內(nèi)外根鞘，在靜止期獺兔毛囊中少見Wnt10b的表達。結果表明Wnt10b可能參與了

9、獺兔毛囊的發(fā)育調(diào)控，并推測其調(diào)控作用途徑為經(jīng)典Wnt通路。
　　4．Wnt10b在獺兔毛囊周期中的作用及作用的信號通路研究
　　進一步研究Wnt10b在獺兔毛囊發(fā)育中的作用，我們采用建立獺兔游離觸須毛囊培養(yǎng)模型和在體注射模型，從組織器官和活體兩方面研究Wnt10b在獺兔毛囊周期變化中的作用。結果表明，Wnt10b腺病毒處理組的觸須毛囊毛干生長速度顯著快于對照組（P＜0.05）。在體注射模型皮內(nèi)注射Wnt10b腺病毒后，處理組

10、的注射部位毛發(fā)生長明顯快于未注射部位。表明Wnt10b對毛囊的生長有誘導促進作用。
　　XAV-939能特異性的抑制經(jīng)典Wnt信號通路，在游離觸須毛囊基礎培養(yǎng)基中加入XAV-939處理，發(fā)現(xiàn)處理組毛囊毛干生長速度顯著慢于對照組，毛干生長速度受到明顯抑制（P＜0.05）。在體注射模型皮內(nèi)注射XAV-939后，處理組的注射部位毛發(fā)生長變慢。因此推測Wnt10b對毛囊的促進作用是通過Wnt經(jīng)典通路來實現(xiàn)的。
　　5．Met對獺兔毛

11、囊發(fā)育相關基因表達的影響
　　選取30日齡斷奶獺兔200只，體重相近，隨機分為4組，飼喂0、0.30％、0.60%、0.90%Met添加水平的日糧。結果表明，不同Met水平、不同飼喂天數(shù)對IGF-I、IGF-IR、EGF、BMP2、FGF-5、Kap3.1、Kap6.1、GHR、TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3等毛囊發(fā)育相關基因的表達量影響不同。
　　高Met添加水平能降低飼喂40d時獺兔背皮中的 BMP2基因表達水

12、平；對KAPs基因表達進行檢測發(fā)現(xiàn)，Kap3.1基因表達僅在飼喂60d時有顯著變化，0.60%Met添加組Kap3.1表達量達到最高（P＜0.05），而Kap6.1基因表達在不同的時間點變化與Kap3.1并不相同。對背皮中EGF基因表達檢測發(fā)現(xiàn)，不同Met添加日糧飼喂60d時基因表達量有顯著變化，0.30%和0.60%Met添加組EGF基因表達水平顯著高于其他兩組（P＜0.05）。
　　對TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3基

13、因表達水平檢測發(fā)現(xiàn)，適當?shù)腗et添加水平能降低獺兔背皮中TGFβ-1和TGFβ-3的基因表達水平。對GHR，IGF-Ⅰ,IGF-ⅠR基因表達規(guī)律分析發(fā)現(xiàn)，日糧Met對不同飼喂天數(shù)獺兔背皮中的GHR，IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因表達影響并未呈明顯的一致性變化。
　　6.Met對獺兔毛囊發(fā)育的影響及Wnt10b參與Met調(diào)控毛囊發(fā)育的機制初探
　　試驗發(fā)現(xiàn)，日糧不同 Met水平飼喂斷奶獺兔60d后，0.30%、0.60%和0.9

14、0%Met添加組的毛囊密度顯著高于對照組毛囊密度，并且毛囊密度在0.60%添加水平時達到最高（P＜0.05）。在體外培養(yǎng)的游離獺兔觸須毛囊中加入Met，發(fā)現(xiàn)30mM、60 mM、90 mM、120 mM、處理組的毛囊生長速度顯著高于對照組和150 mM、Met添加組（P＜0.05），說明適當濃度的Met對毛囊的生長發(fā)育起到促進作用。
　　對日糧不同Met水平飼喂獺兔背皮中Wnt10b、β-catenin總蛋白、磷酸化β-caten

15、in蛋白和 Dsh蛋白進行檢測發(fā)現(xiàn)，隨著不同 Met水平日糧飼喂斷奶獺兔時間的增加，獺兔背皮中Wnt10b、β-catenin總蛋白、磷酸化β-catenin以及Frizzled家族跨膜受體蛋白Dishevelled（Dsh）蛋白的表達呈現(xiàn)一定的規(guī)律性：適量的 Met添加能提高Wnt10b及其相關通路蛋白的表達。這提示，Met對獺兔毛囊的促生長作用可能是通過調(diào)控 Wnt經(jīng)典即Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路來實現(xiàn)的。
　　結論：