番茄青枯病拮抗菌的篩選、鑒定和應(yīng)用研究.pdf

1、番茄青枯病是一類(lèi)危害嚴(yán)重的世界性土傳細(xì)菌病害，它的有效防治已經(jīng)成為番茄生產(chǎn)中亟待解決的難題。本研究從生物防治的角度出發(fā)，分離篩選了對(duì)番茄青枯病有拮抗作用的菌株，通過(guò)溫室盆栽試驗(yàn)和田間小區(qū)試驗(yàn)進(jìn)行了防治效果和田間應(yīng)用效果評(píng)價(jià)。旨在為高效芽孢桿菌的研制和使用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。 主要研究?jī)?nèi)容有以下幾個(gè)方面： 1.從山東壽光和蒼山不同種植年限的蔬菜大棚中分離得到的45株菌株以及中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌庫(kù)中保存的19株菌株中，利用點(diǎn)

2、接法篩選到14株對(duì)茄科勞爾氏菌有拮抗作用的菌株，然后通過(guò)牛津杯法復(fù)篩得到6株抑菌效果較好的菌株。通過(guò)溫室盆栽試驗(yàn)表明拮抗菌X10的防治效果最好，液體菌劑防治效果達(dá)到了81.8％，固體菌劑防治效果達(dá)到了65.4％。 2.對(duì)番茄青枯病拮抗菌X10進(jìn)行了形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征測(cè)定，結(jié)果表明它與側(cè)孢短芽孢桿菌種的特征一致。測(cè)定了菌株的16SrDNA序列并根據(jù)其構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，X10與側(cè)孢短芽孢桿菌形成一個(gè)類(lèi)群，序列同

3、源性為99％。因此將X10鑒定為側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)。 3.從側(cè)孢短芽孢桿菌X10發(fā)酵液中提取的拮抗蛋白粗提液具有抑制茄科勞爾氏菌生長(zhǎng)的效果，該抗菌蛋白粗提液具有良好的熱穩(wěn)定性，能耐90℃的高溫；用蛋白酶處理，其抑菌活性受胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K的影響；對(duì)氯仿敏感；隨著紫外照射時(shí)間的延長(zhǎng)，活性受到影響；拮抗物質(zhì)25℃保存，活性28d內(nèi)基本不變；作用活性pH(pH5.0～11.0

4、)范圍較寬，這對(duì)于芽孢桿菌用于生物肥料的生產(chǎn)和保藏具有一定的理論指導(dǎo)作用。 4.根據(jù)溫室盆栽試驗(yàn)的結(jié)果，制備側(cè)孢短芽孢桿菌X10的固體菌劑，在山東萊陽(yáng)趙旺莊鄉(xiāng)露地蔬菜栽培區(qū)和山東肥城科技示范園的蔬菜大棚里進(jìn)行了小區(qū)試驗(yàn)，對(duì)田間應(yīng)用效果進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明固體菌劑的兩種接種量對(duì)番茄青枯病的防治效果分別達(dá)到了58.42％和68.68％，固體菌劑蔬菜大棚施用能夠促進(jìn)番茄植株生長(zhǎng)和增加產(chǎn)量。 5.提取了側(cè)孢短芽孢桿菌X10的基因

5、組DNA，以綠色熒光蛋白(GFP)為報(bào)告基因，以啟動(dòng)子探針pUC19-GFP為載體，通過(guò)鳥(niǎo)槍法在大腸桿菌DH5a中構(gòu)建了X10的啟動(dòng)子文庫(kù)。通過(guò)篩選獲得了14個(gè)陽(yáng)性克隆，編號(hào)為P1～P14。對(duì)P2、P3、P6、P9、P10、P13和P14克隆中的重組質(zhì)粒的插入片段進(jìn)行了測(cè)序和在線啟動(dòng)子預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示插入片段Ps3和Ps6具有典型的原核啟動(dòng)子的特征，其它五個(gè)插入片段則沒(méi)有典型的原核啟動(dòng)子特征。將Ps6插入到穿梭載體pNW33N的多克隆位點(diǎn)