小鼠宮內移植腹水型惡性腫瘤細胞H-,22-和S-,180-的實驗研究.pdf

1、癌癥是“世紀之魔”、是嚴重威脅人類健康的“第一殺手”。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，當今世界每隔6秒就有一個生命被癌癥奪去。隨著工業(yè)化、居住城市化、人口老齡化進程的加快，以及環(huán)境污染的日益嚴重，癌癥發(fā)病率今后還會持續(xù)上升。盡管人類對腫瘤和發(fā)育的認識由來已久，人類也已步入了后基因組以及各種實驗技術的迅速發(fā)展和應用的時代，但是由于缺乏對腫瘤發(fā)生機理的全面了解，使人們對大多數(shù)嚴重威脅自身生命質量(1ifequality)和生存的惡性腫瘤仍然束手無策；與

2、此同時，雖然人們對個體發(fā)育的認識已經(jīng)滲入到了基因水平，但對于個體的發(fā)生、發(fā)育現(xiàn)象仍存在許多未解的難題，人類對自身的認識——個體發(fā)育的許多問題仍處于探索階段。 早在1829年Lobstein等就提出了腫瘤的胚胎性起源概念，但直到上世紀七十年代癌基因研究的興起才使得這一理論被重新理解和深入，早期胚胎細胞與惡性腫瘤細胞生物學行為的相似性研究日益受到重視；越來越多的學者認為不同胚胎微環(huán)境(包括卵母細胞，囊胚和部分妊娠中、晚期胎兒)可能對

3、攜帶全套遺傳信息的細胞核有“程序重排作用”(reprogramme)而使某些惡性腫瘤細胞的表型逆轉。在九十年代初期，中國和印度等一些國家進行了將引產(chǎn)胎兒的脾細胞等輸入晚期惡性腫瘤患者的臨床治療觀察，發(fā)現(xiàn)能部分延緩患者的生存期，從臨床方面也為這一理論提供了重要證據(jù)。 我們實驗室課題組在建立小鼠囊胚一惡性腫瘤細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的基礎上觀察到了已經(jīng)分化決定的正常細胞一囊胚滋養(yǎng)層細胞在體外能“侵襲”不同侵襲潛能的惡性腫瘤細胞，并形成類似“青

4、霉菌抑菌圈樣”的無腫瘤細胞生長空白帶；一定劑量的抗植入藥米非司酮能有效抑制高轉移潛能的小鼠黑色素瘤的肺轉移率和降低腫瘤的血管生成能力。為了探討胚胎與腫瘤在體內的相互作用，本實驗研究在我們已有的實驗研究及其對早期胚胎發(fā)育與惡性腫瘤相互作用研究的深刻理解基礎上，選擇腹水型惡性腫瘤細胞，著眼于中、晚期的胚胎微環(huán)境與惡性腫瘤細胞的實驗研究，旨在進一步認識惡性腫瘤存在于胚胎微環(huán)境中的生長行為及其對胚胎發(fā)育的影響和惡性腫瘤細胞的轉歸，為理解生命現(xiàn)象

5、的個體發(fā)育和惡性腫瘤生物學行為的內涵提供原始的實驗依據(jù)和技術平臺，為胚胎微環(huán)境逆轉惡性腫瘤細胞表型提供進一步的證據(jù)，推進人類對胚胎與惡性腫瘤相互作用的理解和認識。 目的 1自我構建和自我組織是個體發(fā)育的基本原則，而基因水平的重組和細胞的社會性是闡釋有機體復雜發(fā)育模式的重要觀點，惡性腫瘤細胞所處的微環(huán)境對其發(fā)生、發(fā)展有重要影響。細胞的行為模式不僅受基因等內在因素的影響，還受到鄰近細胞的能量流和信息流的制約，在發(fā)育晚期，還受

6、到機體外部的影響。通過選擇小鼠中晚期胚胎羊膜腔(D9-D12)和腹腔(D13一D21)為胚胎微環(huán)境，采用宮內移植的方法使惡性腫瘤細胞與發(fā)育中的胚胎“共處一室”，探討惡性腫瘤細胞對胚胎發(fā)育的影響，以及胚胎微環(huán)境對惡性腫瘤細胞的細胞生物學行為的影響，從細胞社會學和個體發(fā)育微環(huán)境等方面研究惡性腫瘤細胞與胚胎的相互作用。 2利用全胚胎培養(yǎng)技術，初步探討惡性腫瘤細胞上清液對胚胎的發(fā)育毒性，從體外和單因素的角度來直接觀察惡性腫瘤細胞對胚胎發(fā)

7、育的影響。 3建立穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的腫瘤細胞株，采用細胞生物標記的方法來初步研究移植到胚胎腹腔的惡性腫瘤細胞的生物學行為變化，來初步實現(xiàn)實驗現(xiàn)象的機理探討和研究被移植惡性腫瘤細胞的轉歸。意義 1通過從胚胎發(fā)育生物學的角度認識腫瘤以及對胚胎發(fā)育微環(huán)境與惡性腫瘤細胞相互作用的進一步研究，有利于我們深入地理解胚胎和腫瘤兩種“正．邪”生命現(xiàn)象的內涵，拓展胚胎與腫瘤相互作用研究的新領域，為“腫瘤的胚胎源性”學說提供新的理論依據(jù)

8、。 2通過從特殊移植物的選擇入手，對現(xiàn)有宮內移植免疫理論提出問題，為宮內移植免疫的深入研究提供一定實驗支持。 3通過在發(fā)育生物學和腫瘤學交叉領域研究的嘗試，為研究胚胎與腫瘤相互作用以及對生命現(xiàn)象本質的認識提供新的思維方法和探索方向，也對惡性腫瘤細胞的表型研究提供新的技術平臺。 4通過本研究的實踐，為人們試圖從個體生命現(xiàn)象本身中去尋求認識腫瘤、征服腫瘤建立新的方法學。 材料與方法 1將6×106的H

9、22細胞和8180細胞采用宮內移植的方法移植到NIH胎鼠的羊膜腔(D9-D12)和腹腔(D13-D18)，觀察移植H22細胞和S180細胞后的胎鼠分娩、新生鼠發(fā)育狀況和荷瘤情況。 2采用放射免疫法和RT-PCR觀察H22細胞標記產(chǎn)物AFP的表達，探討移植腫瘤H22細胞后成年鼠微量荷瘤情況；采用兄妹間交配方法觀察雌鼠的妊娠能力，探討有無生殖系統(tǒng)荷瘤。 3采用體外全胚胎培養(yǎng)技術，觀察H22細胞和S180細胞上清液在體外對胚胎

10、的發(fā)育毒性，初步探討腫瘤細胞上清液在體外對小鼠器官形成期胚胎(D8．5胚胎)發(fā)育的影響。 4建立穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的gfp-H22和gfp-S180穩(wěn)定瘤株，采用雙熒光標記法和激光共聚焦掃描技術，觀察H22細胞和S180細胞中PKC,PCNA,P53和MMP-2在移植于胎鼠腹腔后24h,48h,72h后的表達，初步探討被移植腫瘤細胞在胚胎腹腔微環(huán)境的細胞生物學行為。 結果 1被移植惡性腫瘤細胞胎鼠的發(fā)育

11、 通過羊膜腔(D9-D12)和腹腔(D13-D18)移植H22細胞和8180細胞的胎鼠能夠在D19-D21發(fā)育至順利分娩，新生鼠繼續(xù)發(fā)育至成年，其發(fā)育時序、生理指標(包括各時期體重、平面翻正反射、耳廓分離、長出可見絨毛、懸崖回避、強握金屬線、聽覺驚愕、睜眼時間、睪丸下降、陰道開口及出毛)和正常對照組小鼠比較，未見異常；主要臟器肝、肺和腎臟組織切片HE染色、鏡下觀察，結構完整、未見異常細胞和結構。 2被移植惡性腫瘤細胞胎鼠發(fā)育至成

12、年的荷瘤狀況 羊膜腔(D9-D12)和腹腔(D13-D18)被移植H22細胞和8180細胞的胎鼠出生后發(fā)育未見異常而且在新生鼠至成年及長期觀察(最長已達260d)未見肉眼和解剖荷瘤。在移植H22細胞的實驗組和對照組血清中AFP值均顯著低于荷瘤對照(P<0．05)，但實驗組和正常對照組間AFP值無顯著性差異(P>0．05)；RT-PCR發(fā)現(xiàn)，AFP的DNA擴增實驗組和正常對照組為陰性，荷瘤組為陽性。 3H22細胞和8180

13、細胞上清液對小鼠胚胎體外發(fā)育的影響 H22細胞和S180細胞上清液在體外對小鼠胚胎有極強的發(fā)育毒性和致死性。 4小鼠宮內移植后H22細胞和S180細胞的PCNA、PKC、P53和MMP-2表達 H22細胞和S180細胞中PCNA、PKC、P53的表達隨著移植到胎鼠腹腔微環(huán)境后的時間增加明顯降低(P<0．05)，MMP-2無顯著想變化(P>0．05)。 結論 1建立小鼠宮內移植惡性腫瘤H22細胞和S

14、180細胞的動物模型，采用胎鼠羊膜腔和腹腔注射是可行的。 2發(fā)育中的中、晚期胚胎小鼠的微環(huán)境(包括羊膜腔和腹腔)移植惡性腫瘤H22細胞和8180細胞后對胚胎發(fā)育無毒性作用；宮內的胚胎微環(huán)境(包括羊膜腔和腹腔)通過程序重編作用逆轉了惡性腫瘤H22細胞和S180細胞的某些惡性表型，使其不干擾胚胎的整體發(fā)育和保持無瘤狀態(tài)。因此我們推測不僅是早期生命現(xiàn)象的胚胎微環(huán)境即卵母細胞和囊胚腔，而且宮內中晚期的胚胎微環(huán)境即羊膜腔和腹腔也能夠抑制某

15、些惡性腫瘤細胞的增殖和逆轉其部分惡性細胞表型。 3小鼠宮內移植惡性腫瘤H22細胞和S180細胞對胎鼠無生殖毒性、無長期發(fā)育毒性和長期觀察無荷瘤，移植的惡性腫瘤細胞的部分固有惡性表型發(fā)生了改變，表現(xiàn)為：宮內腹腔移植后H22細胞和S180細胞隨著移植時間的增加，PCNA、PKC和P53的表達減弱，而MMP-2的表達沒有明顯變化，推測宮內的胚胎腹腔微環(huán)境可能逆轉了其部分惡性表型，使移植后的腫瘤細胞向低增殖高分化的趨勢發(fā)展，但其浸潤能力