白細胞介素1β誘導衰老成纖維細胞促進角膜新生血管形成的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 本試驗擬研究IL-1β對正常和衰老角膜成纖維細胞狀態(tài)和基因表達的影響，以及IL-1β處理后正常和衰老成纖維細胞對血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移、成管能力上的差別，同時體內(nèi)觀察正常和衰老的成纖維細胞，以及經(jīng)IL-1β處理后的正常和衰老成纖維細胞影響角膜新生血管生長方面的區(qū)別。
　　 方法：
　　 1.人角膜基質(zhì)成纖維細胞（human comeal fibroblasts，HCF）原代及傳代培養(yǎng):供體人角膜取自

2、于眼球捐獻者，無菌條件下，采用消化法原代培養(yǎng)人角膜成纖維細胞，4～5代內(nèi)進行試驗。
　　 2.實驗分組:應用300μMH2O2誘導人角膜成纖維細胞衰老，10ng/mlIL-1β處理正常和衰老的成纖維細胞。衰老成纖維細胞采用衰老相關的β-半乳糖苷酶染色檢測。
　　 細胞分為以下四組。正常對照組（A組）:正常人角膜成纖維細胞常規(guī)培養(yǎng);衰老角膜成纖維細胞組（B組）:H2O2誘導人角膜成纖維細胞衰老;IL-1β組（C組）:IL-

3、1β處理正常角膜成纖維細胞;IL-1β處理的衰老角膜成纖維細胞組（D組）:IL-1β處理衰老角膜成纖維細胞。
　　 3.Real-time PCR檢測各組細胞新生血管相關因子MMPs、VEGF、PEDF、tPA、uPA等的表達。收集四組細胞條件培養(yǎng)液，對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human Umbilical VeinEndothelial Cells，HUVECs)進行誘導處理，采用MTT比色法測定不同成纖維細胞對血管內(nèi)皮細胞的增殖能

4、力的影響，Transwell法測定其對血管內(nèi)皮細胞遷移能力的影響，Matrigel成管實驗評估其對血管內(nèi)皮細胞成管能力的影響。
　　 4.體內(nèi)試驗應用C57/BL6小鼠，分為A、B、C、D四組，左眼為手術眼，行角膜基質(zhì)內(nèi)細胞注射，右眼為對照眼，A組注射正常角膜成纖維細胞，B組注射衰老角膜成纖維細胞，C組注射IL-1β誘導的正常角膜成纖維細胞，D組注射IL-1β誘導的衰老角膜成纖維細胞，并于術后3天、5天、7天、10、14天裂隙燈

5、觀察眼前節(jié)情況并照相，觀察記錄角膜新生血管形成情況。
　　 結果：
　　 1.人角膜基質(zhì)細胞原代和傳代培養(yǎng)
　　 光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)角膜緣組織消化接種2～3天后可見少許細胞爬出，呈梭形排列整齊，4～5天后，相鄰細胞連接向周圍生長，1周后融合，傳代培養(yǎng)2周后，細胞呈現(xiàn)典型的成纖維細胞形態(tài)。
　　 2.處理后四組角膜成纖維細胞光鏡下觀察:B組衰老角膜成纖維細胞形態(tài)較A組正常成纖維細胞體積變大，胞漿內(nèi)顆粒增多增粗，

6、SA-β-gal染色陽性;C組和D組由IL-1β處理正常和衰老的角膜成纖維細胞，前者細胞較正常略有增大，細胞連接緊密;后者細胞增大增寬，排列疏松，胞漿顆粒增多，有雙核現(xiàn)象。
　　 3.Real-time PCR檢測各組細胞新生血管相關因子MMPs、VEGF、tPA、uPA、uPAR等的表達，B、C、D組均明顯高于A組(P＜0.05)，PEDF、TSP1、TSP2、COL1A1、COL4A1，B、C、D組明顯低于A組（P＜0.05

7、）;D組與B組比較，MMP1、MMP2、MMP3、MMP13、tPA、uPA顯著升高（P＜0.05），PEDF、TSP1、TSP2、COL1A1明顯下降（P＜0.05）;D組與C組比較，MMP1、MMP2、MMP3顯著升高(P＜0.05），PEDF、TSP1、TSP2、COL1A1明顯下降(P＜0.05)。B、C、D組HUVECs的增殖、遷移、成管數(shù)量明顯高于A組(P＜0.05);D組遷移、成管數(shù)量明顯高于B、C組(P＜0.05)，但增

8、殖活性的提高不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 4.裂隙燈觀察小鼠術后角膜新生血管情況，A組術后3天角膜緣血管擴張充血，7天時無新生血管長入角膜;B、C組術后3天角膜緣血管擴張充血，7天時新生血管開始向注射區(qū)域生長，10天時長入注射區(qū)域;D組術后3天注射區(qū)域角膜緣有新生血管長入，7天時有大量新生血管向注射區(qū)域生長，10天時大量新生血管長入注射區(qū)域。
　　 結論：
　　 1.衰老的角膜成纖維細胞能夠顯著上調(diào)新

9、生血管促進因子VEGF和MMP的表達，并能顯著下調(diào)新生血管抑制因子PEDF、TSP1和TSP2的表達水平。
　　 2.IL-1β誘導的衰老成纖維細胞比正常細胞和衰老細胞更能夠顯著上調(diào)新生血管促進因子VEGF和MMP的表達，并能顯著下調(diào)新生血管抑制因子PEDF、TSP1和TSP2的表達水平。
　　 3.IL-1β誘導的衰老成纖維細胞比正常細胞和衰老細胞在體外更能促進血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移、成管能力，體內(nèi)更易誘導角膜新生血管